骨髓间充质干细胞接种微孔化脱细胞真皮基质复合自体刃厚皮移植修复裸鼠皮肤缺损的实验研究

万丽，罗旭，辛国华，李安乐，曾逃方，夏卫东，李校堃，林才

（1.温州医学院附属第一医院 病理科，浙江 温州 325000；2.温州医学院附属第一医院 烧伤科，浙江 温州 325000；3.南昌大学第一附属医院 烧伤科，江西 南昌 330000；4.温州医学院 实验动物中心，浙江 温州 325035；5.宜春市人民医院 烧伤科，江西 宜春 336000；6.温州医学院 药学院，浙江 温州 325035）

骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）具有多分化潜能及一定的免疫抑制作用，是组织工程的主要种子细胞之一[1]。在创伤的微环境中，MSCs能分泌多种细胞因子促进创伤的愈合及组织生理功能的恢复，是机体创伤修复的重要组织细胞[2-3]。本研究利用一种已经制备成功的微孔化脱细胞真皮基质（LPADM）[4]，在其上接种MSCs并复合自体刃厚皮移植进行动物在体实验，观察了解其对创面修复的效果。

1 材料和方法

1.1 LPADM的制备 取体质量约25 kg的健康小白猪，电动取皮刀取刃厚皮0.2 mm，去除表皮及基底膜层，然后在真皮组织上再切取约0.3 mm 断层真皮片，高渗盐溶液脱细胞、0.5%戊二醛交联Co60照射处理，在悬空的脱细胞真皮基质上采用电脑激光模板打孔技术（选用规格孔径：135μm，空间隙：1 mm）均匀贯穿性打孔，制作成LPADM真皮支架备用，详见文献[4]。

1.2 MSCs的分离培养 选取4～6周健康雄性SD大鼠[脱臼法处死（动物使用许可证号：SYXK（浙）2010-0150]，无菌条件下取出股骨及胫骨，低糖DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，细胞悬液以1000 r/min离心两次，每次5 min，弃上清及脂肪层。用含10% FBS的低糖DMEM培养基重悬细胞，加入Ficoll细胞分离液的试管中，以2000 r/min离心20 min，吸取单核细胞层，D-hanks液洗涤细胞2次，重悬细胞于含10%FBS的低糖DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养。3 d换液，弃去未贴壁细胞，保留贴壁细胞继续培养，当细胞达到50%融合时，胰蛋白酶消化传代，参照文献[5]方法获得MSCs。

1.3 体外构建MSCs-LPADM、MSCs-PADM材料 超净台环境中将LPADM剪成2 cm×2 cm大小，将LPADM表皮面朝上放于6孔板中，加入到含10% FBS的低糖DMEM培养基中浸润，放入37 ℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中保存4 h。取生长良好的第三代MSCs，胰蛋白酶消化成细胞悬液，调整密度至4×105个/mL，在6孔板LPADM的表皮面接种1 mL的细胞悬液，放入37 ℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中孵育4 h换液，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱培养，每2 d换液一次，共体外培养5 d。以同样的操作同期接种一批无孔化真皮基质（PADM）。构建成MSC-LPADM和MSC-PADM两种含有MSCs的微孔化和无孔化的真皮基质待移植材料。

1.4 动物移植实验 取健康雄性裸鼠18只，体质量约为25 g，随机分为A（6只）、B（6只）、C（6只）三组。3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠（0.01 mL/g），俯卧位固定，同1.1法切取自体刃厚皮，在裸鼠背部正中做一2 cm×2 cm的全层皮肤缺损创面，达深筋膜，将MSCs-LPADM+刃厚皮片组（A组）、LPADM+刃厚皮片组（B组）、MSCs-PADM+刃厚皮片组（C组），移植创基，外用粗网油纱覆盖打包固定，单笼饲养。于术后3、7、14 d处死动物整个移植物（含边缘外0.5 cm）取材。

2 结果

2.1 真皮基质大体观察 所制备的LPADM呈瓷白色，柔软、有弹性，贯穿性微孔结构（见图1）。组织学观察显示真皮基质脱细胞干净，未见细胞成分，镜下示孔径中胶原排列有序（见图2-3）。

2.2 复合皮移植的大体观察 术后3、7、14 d见A、B两组皮片泛红存活；术后7 d，C组皮片苍白或发暗变黑，局部出现干性坏死；术后14 d，C组皮片完全干性坏死。

2.3 复合皮移植的组织学及透射电镜观察组织学观察，术后3 d，A、B两组在移植后真皮基质微孔径结构中均可见空腔样血管结构形成（见图4-5），C组真皮基质中未见血管结构形成（见图6）。术后7 d，A、B两组真皮基质微孔径结构中血管结构更加明显，C组中无血管结构形成。术后14 d，A组真皮基质微孔径结构中可见丰富血管形成，自体刃厚皮与LPADM非孔径结构处也有较多的毛细血管形成，并可见一些非炎性细胞，可能为MSCs（见图7-8），B组真皮基质微孔径结构中同样可见丰富血管形成，真皮基质中存在着少量炎性细胞，但复合皮皮片与真皮基质交接处所形成的毛细血管较A组少，见炎性细胞聚集（见图9-10），C组胶原结构中仅见少量细胞迁入，未见血管形成，皮片与真皮基质仅见少量细胞结构（见图11-12）。

图1 LPADM大体观

图2 LPADM横切面（HE，×400）

图3 LPADM纵切面（HE，×100）

图4 A组创面术后3 d微孔径结构中可见空腔样血管结构形成（HE，×200）

图5 B组创面术后3 d微孔径结构中可见空腔样血管结构形成（HE，×200）

图6 C组术后3 d胶原结构中未见血管结构（HE，×200）

图7 A组术后14 d微孔径结构中血管形成，其内可见红细胞（HE，×200）

图8 A组术后14 d皮片与真皮基质交接处可见一层新生细胞（HE，×200）

图9 B组术后14 d微孔径结构中血管形成，其内可见红细胞（HE，×200）

图10 B组术后14 d皮片与真皮基质交接处见炎性细胞聚集（HE，×200）

图11 C组术后14 d胶原结构中仅见少量细胞迁入，未见血管形成（HE，×200）

图12 C组术后14 d皮片与真皮基质仅见少量细胞结构（HE，×200）

图13 A组术后14 d刃厚皮片与真皮基质交接处新生无髓神经末梢（TEM，×20000）

透射电镜显示A组复合皮的皮片与真皮基质交接处有较多的毛细血管形成，并发现新生的无髓神经样结构。在真皮基质的浅层，可见单个皮脂腺样细胞，深层见单个汗腺样细胞，但未见到毛囊细胞（见图13-14）。B组复合皮皮片与真皮基质交接处所形成的毛细血管较A组少，可见中性粒细胞迁入。B、C组均未见神经样结构及单一腺细胞。

图14 A组术后14 d微孔化真皮基质浅层出现单个类似皮脂腺细胞（TEM，×6000）

3 讨论

复合皮移植及其生理功能的重建，一直是皮肤深度损伤（如烧伤、创伤、慢性溃疡等造成）创面治疗的重要课题[6-8]。临床上深度烧伤患者行脱细胞真皮基质复合自体皮移植后，短期内往往不能实现移植皮片与真皮基质的紧密结合，创面愈合后更是缺乏毛囊、汗腺等皮肤附属器官，导致复合皮的生理功能得不到有效地重建[3，8-9]。之前我们已制备了一种LPADM，实验证实这种真皮基质能够实现较快速的血管化，实现移植皮片与真皮基质的紧密结合[4]。本研究即在此基础上，接种MSCs于LPADM，并通过动物移植观察在体微环境中MSCs的可能作用，从而为重建皮肤生理功能提供可能。

LPADM中孔径结构的存在，可能使得移植的早期MSCs成活并行使功能。Inoue等[10]在糖尿病大鼠的全层皮肤缺损模型上移植接种有MSCs的人工真皮，发现MSCs在创伤愈合过程中会停留在皮肤受损部位，并可通过促进移植物的血管化程度来加速皮肤创伤的愈合。本研究中，接种有MSCs的LPADM和没有接种MSCs的LPADM，在体移植后均实现了良好的血管化，这与LPADM材料本身具有较快速实现血管化能力有关[4]。而在微孔结构以外的胶原中，接种有MSCs的LPADM可见毛细血管的形成，提示接种的MSCs对真皮基质的血管化具有一定的促进作用。另外研究中电镜发现MSCs-LPADM+刃厚皮片组移植的刃厚皮片下有更多的毛细血管形成，也进一步证实MSCs的促血管化作用。

MSCs接种成活后，能够在创面的微环境中分泌多种促进创伤修复的细胞因子，这些细胞因子作用于复合皮，促进了复合皮血管、神经的再生[3，11]。本研究中电镜显示在MSCs-LPADM+刃厚皮片组复合移植的真皮基质中，炎症细胞的数量即明显少于LPADM+刃厚皮片组。MSCs-LPADM+刃厚皮片组复合移植术后14 d，在真皮基质的浅层，除了可以看到新迁入的成纤维细胞和少量的炎症细胞之外，更发现皮脂腺样细胞，无髓鞘神经样末梢结构，深层则见到汗腺样细胞，但没有看到毛囊样结构。这究竟是外源性添加的MSCs多向分化的结果，还是自身刃厚皮片残留的皮肤附件多种细胞增生，向下迁移的结果呢？如果是刃厚皮片自身残留的皮肤附件结构或者自身残留附件增生，电镜下应为成熟的具有功能的结构，而不应是目前我们实验中看到的这些单一类汗腺样细胞、单一类皮脂腺样细胞及无髓样神经样结构，因此，它们来源于外源性MSCs的可能性更大，即可能是由刃厚皮片中残留的皮肤附件诱导外源性MSCs在体内微孔化LPADM微环境下增殖、分化的结果。

总之，我们认为，LPADM复合移植给提前种植的外源性MSCs提供较为理想的增殖分化微环境。对重建移植后皮肤功能提供了一种方法或思路。

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