Cyclin D1在急性白血病骨髓组织中的表达及临床意义＊

陕西中医学院第二附属医院血液科 （咸阳712000） 杨 艳 王越月 何春玲 田亚宁周智辉 张云志 闫昱江 张 杨 刘 芳 梁漫 董红保 董昌虎

细胞周期素D1（Cyclin D1）是细胞周期G1期周期素家族最重要的成员，其表达失控将引起细胞增殖周期失调，而导致肿瘤发生；现已发现，多种组织来源的肿瘤均有Cyclin D1的过度表达，但有关急性白血病（AL）骨髓组织中该蛋白的研究很少；本实验通过免疫组化染色方法，检测Cyclin D1单克隆抗体在急性白血病及正常对照组骨髓组织中的表达，并结合急性白血病的临床分型，探讨Cyclin D1在急性白血病发生、发展及预后中的作用。

资料与方法

1 一般资料 本院2010年1月1日至2012年6月30日确诊为急性白血病49例患者的骨髓组织标本，其中男27例，女22例，年龄16～76岁，中位年龄48岁；急性髓细胞白血病36例（其中3例由骨髓增生异常综合征转变而来、2例由慢性髓细胞白血病急变而来），急性淋巴细胞白血病13例；49例患者中29例为初诊患者，13例为复发患者，7例完全缓解患者。正常对照组19例，来自陕西中医学院第二附属医院病理科诊断的正常骨髓组织。

2 方法及步骤 取经冷丙酮固定、塑料包埋的存档骨髓组织块，制成2～3μm组织切片，裱片于用稀释多聚－L－赖氨酸处理的载玻片上，吹干，用专用油笔圈定玻片上的待测组织区域，PBS液冲洗后滴加100μl Cyclin D1抗体（兔抗人单克隆抗体，福建迈新生物科技有限公司，批号：120510541B），室温下孵育60 min后PBS液冲洗，加100μl酶标羊抗小鼠/兔Ig G聚合物，室温下孵育15 min，PBS液冲洗后加100～200μl新鲜配制的DAB显色液，室温下孵育3～5 min，自来水冲洗，加苏木素染色至细胞核浅蓝色，PBS液冲洗返蓝；酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察，判断结果。

3 判断标准 Cyclin D1判断标准：以细胞核呈弥漫的棕黄色颗粒为阳性细胞，在显微镜下观测，选择2个高倍视野，计数200个有核细胞中Cyclin D1着色的细胞比例数，求出平均值，根据阳性细胞所占的百分率分为以下五个等级：无阳性细胞者为阴性；1%～10%为（＋）；11%～20%（）；21%～30%（）；≥31%（）。

4统计学方法 采用SPSS17．0软件包进行Mann－Whit ney Test秩和检验及χ2检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 Cyclin D1在急性白血病组及对照组骨髓组织中的表达 见表1。分组变量检验统计结果显示：统计量U＝304．000，双侧渐近概率P＜0．05，故可认为急性白血病组与对照组的Cyclin D1表达差异有统计学意义。

表1 Cyclin D1在急性白血病组及对照组骨髓组织中的表达

2 Cyclin D1在初发未治、复发难治及完全缓解的AL的表达 见表2。复发难治患者（8/13）骨髓组织中Cyclin D1的表达高于初发未治患者（9/29），3组资料比较，差异有统计学意义（P＜0．05）。

表2 Cyclin D1在初发未治、复发难治及完全缓解的AL的表达

3 Cyclin D1在急性白血病骨髓组织中表达的特点 见附图。急性白血病骨髓组织中用Cyclin D1抗体，经S－P染色后，可见骨髓内出现阳性细胞的表达在细胞核上。

附图 急性白血病骨髓组织中Cyclin D1经S－P染色阳性细胞（×40）

讨 论

在恶性肿瘤发生机理的研究中，越来越多的研究表明，细胞周期素（Cyclins）－细胞周期素依赖性激酶（CDKs）－细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白（CKIs）系统作为细胞分裂、增殖的调控网络，在肿瘤的发生学上起着极为重要的作用，Cyclin D1能够激活细胞周期素依赖性激酶（CDKs），调控细胞的分裂和增殖，阻滞Cyclin D1的表达可阻断细胞从G1期进入S期，而Cyclin D1的过度表达，可导致p RB蛋白的磷酸化修饰提前实现，加速细胞G1期到S期的转变，促进细胞的增殖［1］；Cyclin D1是G1期周期素，其活化是肿瘤发生的重要原因之一［2］；近几年的研究已经发现在子宫内膜癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌等多种肿瘤中都存在Cyclin D1基因结构和功能异常［3－8］；它在诊断、治疗及预后评估上的应用价值也是目前肿瘤研究中的热点之一，但有关Cyclin D1在骨髓组织中的表达却鲜见报道。

白血病是血液系统最常见的恶性肿瘤，我们对急性白血病骨髓组织中Cyclin D1的表达研究发现，正常骨髓中未见Cyclin D1的表达，而急性白血病组骨髓组织中Cyclin D1的阳性率为34．69%，提示Cyclin D1的异常表达与血液系统最常见的恶性肿瘤—急性白血病的发生有一定的关系；有研究表明，几乎所有的cyclins都可能作为一种原癌基因被激活后在肿瘤发生中起癌基因的作用［9］，吴玉新等［10］研究也表明细胞周期素D1与多种不同类型人类肿瘤的诊断和预后有关。

研究的49例急性白血病患者中，有32例患者未出现Cyclin D1的表达，而有17例患者均不同程度的出现Cyclin D1的表达，其中复发难治患者的阳性率高于初发未治患者，尤其是3例由骨髓增生异常综合征转变的急性髓细胞白血病患者中有2例Cyclin D1呈高表达（／），2例由慢性髓细胞白血病急变而来的急性髓细胞白血病患者Cyclin D1均呈高表达（／），7例完全缓解患者中Cyclin D1的表达均为阴性，其结果与李红华等［11］所研究结果相似；对上述急性白血病患者化疗1～2周期后缓解情况进行观察显示，Cyclin D1阴性表达患者的缓解率明显高于其阳性表达患者，提示Cyclin D1的阳性程度与急性白血病的临床病情及预后情况有一定关系，其高表达往往提示病情危重，预后较差。

在研究的49例急性白血病患者中，急性髓细胞白血病及急性淋巴细胞白血病中均有Cyclin D1的表达，但由于病例过少，差异无统计学意义，对二者是否存在差异还需进一步积累资料。

综上所述，急性白血病骨髓组织中Cyclin D1表示属无毒级，致癌、致畸及致突变实验和细菌培养均为阴性［3］，成人急性毒性实验结果为LD50＞13g/kg，属实际无毒级；无致癌、致畸性；另外，它还能在体内分解、排泄，无毒性累积［4］。

使用医用胶固定补片的另一个顾虑是其可降解性，因α－氰基丙烯酸酯聚合体在体内可以被代谢，完全排泄。但其在体腔内和组织内反应的实验表明，化学性医用胶用于人体和动物体内，根据用胶量，将于3～9个月才被逐渐降解吸收；而根据补片修补的原理，对于有足够微孔大小的疝补片来说，成纤维细胞浸润和胶原纤维蛋白的形成、且产生较稳定的瘢痕组织大约需要1个月时间，组织损伤修复的纤维增生期也在1个月内完成，而术后3个月植入补片与宿主组织的融合已相当牢固。因此，虽然化学性医用胶在体内使用后3～9个月降解吸收，但已为维持补片的固定提供了充足时间。也有人认为该医用胶28d后的强度比缝线低30%［5］，故并不能完全代替手术缝线，只是用于伤口的边缘且要配合缝线一起使用［6］。

医用胶在腹外疝术中使用注意事项。由于化学性医用胶是一种粘合封闭剂，凝固快，会形成坚硬的胶合，封闭网孔，所以易造成感染或形成补片下的血肿与血清肿，所以我们的经验是应该点状应用于补片的粘合，而不能大面积涂抹封闭；手术创面使用医用胶也应采用少量、薄层涂抹止血的方法。

在无张力疝修补术中应用一些新工艺、新材料，并借此来降低术后各种并发症的发生和提高疗效是疝外科发展的一大趋势。我们在腹股沟疝Lichtenstein平片无张力修补术中应用化学性医用胶固定补片和创面止血取得了较好疗效，没有因为补片固定不牢靠而复发的病例，没有发生伤口感染，可以减轻术后疼痛，减少慢性疼痛和血肿的发生，节省了手术时间。

［1］Obilski W，Dobosz M，Wojciechowicz T，et al．Lichtenstein inguinal hemioplasty using butyl－2－cyanoacr ylate versus sut ures，preli minar y experience of a prospective rando mized trial［J］．Eur Surg Res，2004，36：367－370．

［2］王养忠，朱 预，周丽君，等．EC耳脑胶在眶壁修复术中应用［J］．中国实用眼科杂志，2004，22（5）：400．

［3］张 健，杨宝贺，秦怀海，等．医用胶自体颅骨碎片原位粘合成形术［J］．中华神经外科杂志，1998，14（3）：178－179．

［4］李桢林，杨 蓓，范和平．丙烯酸酯类胶黏剂研究新进展［J］．河南化工，2004（7）：4－7．

［5］徐 梅，赵 敏，李 鸿．α－氰基丙烯酸正辛酯在小梁切除术中应用的初步报告［J］．眼外伤职业眼病杂志，2007，29（8）：581－583．

［6］Davis SC，Eaglstein WH，Cazzaniga AL，et al．An octyl－2－cyanoacrylate for mulation speeds healing of partialthinckness wounds［J］．Der matology Surger y，2001，27（9）：783－788． （收稿：2012－05－15）

［7］Kitamura Y，Nino miya．Smad expression of hepatic stellate cells inliver cirr hosis in vivo and hepatic stellate cell line in vitro［J］．Pathol Int，2003，53（1）：18－26．

［8］Kir wan RP，Leonard MO，Mur phy M，et al．Transf orming growthfactor－beta－regulated gene transcription and protein expression in hu man GFAP－negative lamina cribrosa cells［J］．Glia，2005，52（4）：309－324．

［9］Gressner A M，Weiskirchen R，Breitkop Fk，et al．Roles of TGF－beta in hepatic fibr osis［J］．Front Biosci，2002，7（1）：793－807．