高星杰 ,葛 林 ,付 雪 ,张 毅 ,宋 娟 ,何津岩 ,姚 智 ,3,杨 洁 ,
(天津医科大学1.基础医学研究中心;2.生物化学系;3.免疫学系,天津300070)
G3BP是一种能够与GAP(the Ras-GTPase-activating protein)的 SH3(Src Homology 3)结构域结合的胞浆蛋白[1],它在机体发育、细胞周期调控、信号传导通路、应激颗粒及相关疾病的发生发展过程中发挥重要作用。本实验即是在绿色荧光标记的G3BP蛋白基础上,利用pmCheery-C1/pEBFP-N1质粒载体,进一步进行红色与蓝色荧光标记,从而实现活细胞内对于该蛋白的三色荧光标记,有助于进行细胞荧光方面的研究,为深入研究此蛋白的生物学功能提供便利工具。
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株及细胞 真核表达质粒pEGFPC1-G3BP由Jamal Tazi博士馈赠;pmCherry-C1载体由Johan Perane博士馈赠;pEBFP-N1载体购自美国Clontech公司;Tran1-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;HeLa细胞来自本实验室。
1.1.2 酶类及主要生化试剂 限制性内切酶EcoRI、BamHI及T4 DNA连接酶均购自Fermentas公司;Taq酶购自北京鼎国昌盛生物技术公司;T/A载体(pEASY-T1)购自北京全式金生物技术有限公司;B型小量DNA快速回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司;质粒快速小提试剂盒购自北京索来宝科技有限公司;去内毒素质粒提取试剂盒购自 Promega公司;Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。BCA蛋白测定试剂盒购自Pierce公司;鼠源抗BFP单克隆抗体购自MBL公司;鼠源抗G3BP单克隆抗体购自Abcam公司;辣根过氧化物酶标记的抗鼠源IgG二抗购自Fermentas公司;LumiGLo化学发光底物购于KPL公司;细胞荧光封片液(含DAPI染料)购自Santa公司。
1.1.3 其它 激光共聚焦荧光显微镜(基础医学研究中心)购自日本Olympus公司;引物合成及基因测序工作由北京天一辉远公司完成。
1.2 方法
1.2.1 目的片段的获取 参照质粒快速小提试剂盒内说明书提取pEGFP-C1-G3BP质粒DNA。根据G3BP(NM_005754.2) 序列设计含有 EcoRI和BamHI限制性内切酶位点的引物序列(表1),以pEGFP-C1-G3BP质粒 DNA为模板,PCR扩增G3BP基因CDS片段,条件为95℃预变性5 min,95℃30 s,60℃45 s,72℃3 min共33个循环,72℃延伸10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定,紫外灯下切割含有目的条带的凝胶块,利用凝胶回收试剂盒进行目的片段回收,在T4 DNA连接酶作用下,与pEASY-T1(T/A载体)25℃连接15 min。连接产物转化Tran1-T1感受态细胞,在含有氨苄/卡那霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆,摇菌扩增并提取质粒。以EcoRI和BamHI进行双酶切,凝胶回收试剂盒回收并纯化各目的片段。
表1 G3BP基因目的片段引物序列Tab 1 The primer sequence of targeting G3BP gene fragment
1.2.2 线性载体的获取 以质粒快速小提试剂盒提取pmCherry-C1/pEBFP-N1质粒DNA,其图谱信息见图1;进行EcoR I、BamHI双酶切后,完整切下线性pmCherry-C1/pEBFP-N1质粒载体,1%琼脂糖电泳分离。凝胶回收试剂盒回收得到约4700 bp线性pmCherry-C1/pEBFP-N1。
图1 pmCheery-C1/pEBFP-N1质粒图谱Fig 1 pmCheery-C1/pEBFP-N1 vector map
1.2.3 重组真核表达质粒pmCherry-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP的构建 在T4 DNA连接酶作用下,将线性pmCherry-C1/pEBFP-N1质粒载体与具有相同粘性末端的G3BP目的基因片段进行22℃连接过夜。连接产物转化Tran1-T1感受态细胞,在含有卡那霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆,摇菌扩增并提取重组质粒。
1.2.4 单、双酶切及基因测序鉴定 用EcoR I和BamHI对重组质粒 pmCherry-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP进行单、双酶切,并以1%的琼脂糖凝胶电泳验证片段的大小。同时,对重组质粒进行基因测序鉴定。
1.2.5 HeLa细胞的转染及荧光显微镜观察 以去内毒素质粒提取试剂盒提取无内毒素重组质粒。HeLa细胞分别接种至60 mm培养皿(用于蛋白印迹检测)或辅有盖玻片的12孔板(用于激光共聚焦观察)中,置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,37℃、5%的CO2培养箱中培养,至细胞80%汇合时,依据产品说明书进行脂质体瞬时转染pmCherry-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP。转染后48 h,给予0.5 mmol亚砷酸盐处理1 h,将12孔板内盖玻片取出,并以细胞荧光封片液过夜封片处理,最后以激光共聚焦观察pmCherry-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP的细胞内表达与定位。
1.2.6 Western印迹检测融合蛋白表达 先以预冷的1×PBS溶液洗涤转染后HeLa细胞3次,加入预冷的NP-40裂解液裂解细胞,晃动培养板数次以确保裂解液完全覆盖细胞,用无菌的细胞刮刮取细胞并转移至一个1.5 mL Eppendorf管中,冰浴20 min。超声破碎细胞后4℃、12000 r/min离心10 min,取上清获得全细胞裂解液,以BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。裂解液中加入SDS上样缓冲液(50 mmol/L Tris-Cl pH6.8,2%SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油,2.5%β-巯基乙醇),99℃热变性5 min,进行8%SDS-PAGE电泳。电泳结束后,以半干转印法将凝胶上蛋白转移至PVDF膜,用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭2 h,鼠源抗BFP或G3BP单克隆一抗4℃孵育过夜。TBST溶液洗膜3次,每次10 min,加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠源IgG二抗室温孵育2 h,TBST溶液再次洗膜3次,每次10 min,最后加入LumiGLO化学发光底物后暗室曝光。
2.1 PCR扩增目的片段 利用表1中所设计的引物以pEGFP-C1-G3BP为模板进行PCR扩增,再以1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,结果在1400 bp左右观察到与目的片段长度相符的荧光条带(图2)。
图2 G3BP目的片段Fig 2 Targeting G3BP gene fragment
2.2 线性pmCherry-C1/pEBFP-N1质粒载体的获取 采用EcoRI、BamHI双酶切pmCherry-C1/pEBFPN1质粒,切下完整的线性质粒载体,经1%的琼脂糖凝胶电泳,可在4700 bp左右出现条带(图3),纯化回收后用于后续的连接反应。
图3 线性pmCherry-C1/pEBFP-N1质粒载体Fig 3 Linear pmCherry-C1/pEBFP-N1 plasmid vector
2.3 重组真核表达质粒pmCherry-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP的鉴定
2.3.1 单、双酶切及测序鉴定 将构建的重组质粒分别进行EcoRI和BamHI的单、双酶切,产生的条带大小与预期相符(图4),重组质粒基因测序结果也正确,证明G3BP目的片段已成功插入到pm-Cherry-C1/pEBFP-N1的多克隆位点上。
图4 pmCherry-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP的单、双酶切鉴定Fig 4 The single/double enzyme digestion of pmCherry-C1-G3BP/pEBFP-N1-G3BP
2.3.2 荧光显微镜下观察重组质粒表达 在12孔板内进行HeLa细胞爬片处理,脂质体瞬时转染pmCheery-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP,培养48 h后应激处理并封片过夜,在激光共聚焦显微镜下观察拍照。结果显示在未给予亚砷酸盐(0.5 mmol Arsenite)处理组可观察到红色及蓝色荧光标记的G3BP蛋白表达呈胞浆分布;而给予亚砷酸盐处理组可在胞浆中检测到应激颗粒的形成(图5)。
图5 荧光显微镜下观察重组质粒的表达Fig 5 The expression of recombinant plasmid by fluorescence microscope
2.3.3 Western印迹法检测融合蛋白表达 分别收集转染有pmCheery-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP的细胞(其中以转染pEGFP-C1-G3BP的细胞为阳性对照),再以针对BFP、G3BP的单克隆抗体检测BFP/Cherry-Red融合蛋白的表达。G3BP蛋白分子量分别为 60 ku,BFP 为 27 ku,Cherry-Red 为 26.7 ku,两者融合后分别为87 ku,86.7 ku。Western印迹法检测出与目的融合蛋白分子量相符的蛋白条带(图6),表明Cheery-G3BP与BFP-G3BP融合蛋白的成功表达。
图6 Western印迹结果Fig 6 Western blot result
研究发现,G3BP是构成应激颗粒(stress granules,SGs)的组分之一。应激颗粒是真核细胞在受到氧化应激、热休克、紫外线照射及病毒感染等各种环境刺激时在胞浆内形成的颗粒物质,是机体的一种保护机制。应激状态下,细胞会通过特定机制中止mRNA的翻译,并在多种蛋白因子的作用下将翻译中止的mRNA运输到SGs中暂时储存起来[2]。G3BP蛋白就是SGs聚集的效应器,常作为SGs的一种标志性蛋白因子[3-4],如图5B,5D所示。SGs中的mRNA被储存在异常中断的翻译起始复合物中,随后可进入翻译起始或者发生降解[5]。当细胞暴露于亚硝酸盐时,G3BP被招募至SGs。因此,G3BP可能决定细胞应激反应时mRNA的命运。过量表达G3BP也可诱导SGs聚集。此外,研究还发现G3BP可参与NF-kB信号的传导、泛素介导的蛋白质降解、无脊椎动物和脊椎动物的发育、乳腺癌、食管鳞状癌及丙型肝炎的发生、发展等[6-11],故研究这种多功能蛋白具有非常重要的意义。
本实验将G3BP蛋白基因序列成功插入到pm-Cheery-C1/pEBFP-N1质粒载体中,在已有的绿色荧光G3BP基础上构建红色与蓝色荧光重组质粒,其可与其它功能性的绿色荧光重组质粒共同转染入真核细胞,通过共聚焦显微镜技术进行共定位分析,研究G3BP蛋白与特定蛋白或核酸的结合关系,不断发现新的作用伙伴。比如,我们共同转染pEGFPC1-Tudor-SN、pEBFP-N1-G3BP及 pmCheery-C1-DCP1观察三者的共定位关系;转染pmCheery-C1-G3BP与oligoDT(30)-FITC观察G3BP与mRNA的相关性等。值得注意的是pEBFP-N1-G3BP不适合于活细胞工作站的实时监测,因为其激发光对于细胞有较大的损伤,故仅用其来做普通细胞荧光实验。
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