中国人群2型糖尿病相关基因的关联分析及基因型交互作用研究

焦红肖 ，蔡春友 ，魏凤江 ，时文涛 ，陈莉明 ，林静娜 ，韩鸿玲 ，凌 超 ，于 萍 ，吕 佳 ，杨付花 ，李明珊 ，冯淑芝，李卫东

（1.天津医科大学基础医学研究中心，天津300070；2.天津医科大学代谢病医院，天津300070；3.天津市人民医院，天津300121；4.天津医科大学总医院，天津300052）

2型糖尿病是由包括遗传因素及环境因素在内的多种因素共同作用导致的复杂性状疾病之一，由慢性血糖水平升高所导致，并以胰岛素分泌受损和（或）胰岛素抵抗为临床特点[1-2]。目前，全球成年人的糖尿病患病率达到6.4%，约2.85亿，预计到2030年将增加至7.7%，约4.39亿[3]。因此，关于2型糖尿病的研究已成为近年来的热点之一。随着全基因组关联分析（genome wide association studies，GWAS）在遗传学研究中的应用，越来越多的2型糖尿病易感基因被发现，迄今为止已发现了40多个[4]，然而，这仅解释了疾病遗传机制的一小部分原因，基因型交互作用的研究将进一步地解释疾病遗传的部分原因，增加疾病的遗传风险预测度。由于复杂性状疾病不仅受到遗传因素的影响，还有环境因素的作用，因此不同的种族背景、地域环境等都可能造成不同的研究结果。本研究主要选取一些糖尿病候选基因，通过病例-对照研究，一方面检测已知的易感基因在不同人群中与2型糖尿病的关联性，另一方面通过关联分析以及交互作用分析以期发现新的易感基因位点。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究从天津医科大学代谢病医院、天津医科大学总医院、天津市人民医院、天津医科大学眼科医院4家医院随机收集了1463名无血缘关系的中国天津地区人群为研究对象，其中病例组为2型糖尿病患者915名（男性500名，女性415名），平均年龄为（58.36±12.27）岁，以 2010年美国糖尿病协会公布的糖尿病诊断标准为参照标准确定[空腹血糖（FPG）≥7.0mmol/L，及/或口服糖耐量试验（OGTT）2 h血糖（P2hG）≥11.1 mmol/L]；对照组为非糖尿病患者548名（女性84名，男性464名），年龄≥70岁，血糖正常（FPG<6.1 mmol/L）。调查和取样均征得受试者本人同意并签订知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 根据高盐法，应用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，Nanodrop（微量紫外分光光度计）测定其浓度和纯度以确保达到使用要求，-80℃储存备用。

1.2.2 候选基因的选取 根据以往国内外报道及本实验室前期研究结果，选取17个与2型糖尿病相关的基因作为候选基因 [选取的单核苷酸多态性（SNP）位点见表 1]。

表1 选取的候选基因SNP位点Tab 1 SNPs selection for type 2 diabetes candidate genes

1.2.3 基因分型 1463例样本的基因分型由基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-T-OF MS）（华大基因）技术平台进行，每批次的基因分型结果均录入Filemaker Pro数据库进行整理。

1.3 统计学分析 在统计分析之前应用SPSS17.0软件先对样本表型资料进行统计描述，运用PLINK[5]软件对二分变量（糖尿病与非糖尿病）进行病例-对照的关联分析与基因型交互作用的研究。

2 结果

2.1 基因交互作用 通过PLINK软件对21个位点之间进行了两两配对的基因型交互作用分析，得出6对SNP×SNP之间存在较为显著的交互作用（P<0.05），即 ABI2 与 MYH9、LPHN3 与 LIMK2、ABCG2 与 TOX、NUB1 与 CDKN2A/B、TBX5 与SMAD3、LIMK2与 SFI1（表 2）。其中 CDKN2A/B、ABCG2、LPHN3不仅在关联分析中得出与2型糖尿病存在显著的关联性，而且在基因型交互作用中也与2型糖尿病存在一定的相关性。另外，基因型交互作用的研究检测出一些单个SNP位点所检测不到的微效基因，例如：ABI2、MYH9、TOX、TBX5、SMAD3等。

表2 2型糖尿病病例-对照的基因型交互作用结果Tab 2 Genotype interactions(epistasis)associated with type 2 diabetes in cases and controls

2.2 关联分析 通过对样本17个基因21个SNP位点进行病例-对照的关联分析得出5个基因的5个SNP位点与2型糖尿病之间的关联性达到显著水平（P<0.05），分别为 CDKN2A/B（rs10811661，P=2.910×10-5）、IGF2BP2（rs4402960，P=0.0006）、CDKAL1（rs7756992，P=0.0028）、LPHN3（rs6856526，P=0.0031）、ABCG2（rs2231142，P=0.0315）（表 3）。其中 CDKN2A/B、IGF2BP2、CDKAL1 这 3 个基因是笔者对先前研究结果的一个验证，LPHN3、ABCG2与2型糖尿病的关联性是一个较新的发现。分析过程中剔除了一些基因分型过程中未被检测到的位点，使得各个位点的病例、对照数不一定相同。

表3 2型糖尿病病例-对照关联分析中有显著关联的SNPsTab 3 SNPs significantly associated with type 2 diabetes in cases and controls

3 讨论

通过本次研究我们检出了5个基因与2型糖尿 病 相 关 ， 即 CDKN2A/B、IGF2BP2、ABCG2、LPHN3、和CDKAL1。随着“人类基因组计划（human genome project，HGP）”和“人类基因组单体型图计划（the international haplotypemap project，HapMap）”的相继完成，高通量基因分型技术的飞速发展，GWAS已成为目前遗传学最为流行的研究手段。近年来，大量关于2型糖尿病的GWAS研究使得相当一部分易感基因被逐渐发现，CDKN2A/B、IGF2BP2、CDKAL1也在大量的GWAS研究中得出与2型糖尿病相关，并在不同人群中得到验证[6-8]。我们的实验进一步验证了这一结论，而Tsai等[9]在中国汉族人群的GWAS研究中并没有得出CDKAL1、IGF2BP2与2型糖尿病之间存在相关性，这可能是由于遗传异质性、表型复杂性、种族差异以及地域差异等原因造成的。

关于 CDKN2A/B、CDKAL1、IGF2BP2 与 2 型糖尿病的研究不仅仅是遗传学上的，生物学上研究得出 CDKN2A/B[10-12]、CDKAL1[11-12]参与细胞周期蛋白依赖的激酶通路，并可能因此影响β细胞的再生而使胰岛素分泌减少造成血糖水平升高，IGF2BP2编码IGF2的mRNA结合蛋白并在蛋白合成过程中指导mRNA到特定的亚细胞位置上，与胰腺的发展相关[12]，可能会增加胰岛素抵抗[13]，增加2型糖尿病的发病风险。

LPHN3在人体内编码G蛋白偶联受体的蛛毒素受体亚科，蛛毒素受体参与细胞粘附和信号转导功能。ABCG2编码ATP结合盒亚家族G成员2，在胎盘期已显著表达。有研究表明ABCG2在肝脏和肾脏表达，可能与尿酸等的转运有关[14]。在本次的病例-对照研究中，通过关联分析我们得出LPHN3和ABCG2与2型糖尿病之间的关联已达到统计学上的显著水平，并在基因型交互作用研究中也得出LPHN3、ABCG2均与其他基因存在交互作用，从而可以推出这两个基因可能与2型糖尿病的发生、发展相关。Zemunik等[15]通过GWAS研究得出LPHN3与HDL之间存在显著关联。本实验室在关于2型糖尿病的数量性状研究中已得出MYH9和ABI2基因的多态性与血糖、血压和胰岛素抵抗相关表型存在关联，并且在以胰岛素敏感性指标为表型的交互作用的研究中得出ABCG2与ABI2之间存在显著的交互作用[16]。上述实验仅是病例组的数量性状研究，目的在于研究候选基因与2型糖尿病各表型之间的关系；而本次的研究是在上述实验的基础上，扩大样本量，设置正常对照组，进行关于2型糖尿病二分变量（患病和非患病）的病例-对照研究，在试验设计、研究对象和关联分析的方法上均有很大不同。在本研究中，我们得到的是对2型糖尿病患病状态本身的关联。

单纯的候选基因的关联分析或GWAS不能检测位点间的交互作用对性状的影响[17]，而现有的2型糖尿病基因不能解释该疾病的较高遗传度。Manolio等[18]认为基因交互作用、微效基因和拷贝数变异与这些“丢失的遗传度”有关。然而，由于本次研究检测的位点数尚少，因而基因型交互作用的结果不是太显著，本研究检测了一些已知的糖尿病相关位点之间的交互作用，关于大量位点间的基因型交互作用的研究有待下一步完成。

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