转录调节因子p8分泌表达载体的构建及在Fx293细胞中的表达

薛珊珊，王晓洋，李 丁，牛 卿，马振毅

（天津医科大学基础医学院1.免疫学系；2.生物化学与分子生物学系，天津300070）

近年来在实体肿瘤细胞转移研究中发现，p8由于其潜在的多方面功能而逐渐引起了重视。p8/NUPR1（Nuclear protein 1）/com-1（candidate of metastasis-1）是一个只有82个氨基酸的转录调节因子，没有稳定的二级结构。p8基因剪切后形成亚型a或亚型b。迄今为止，关于p8的生物化学和分子生物学研究都是集中于亚型b，所以通常p8指的是亚型b。长亚型a比短亚型b多了18个氨基酸，这个外加的18个氨基酸的功能尚不完全清楚。在多种应激条件下p8可以被诱导表达，其生物学功能似乎和细胞所处的内外环境相关，比如可以诱导肿瘤细胞生长和转移[1-3]或抑制肿瘤的生长[4-5]，也有实验证实p8和内质网胁迫诱导的细胞自噬相关[6]。在不同的组织中，p8功能也不同，甚至功能相反。在胰腺癌和乳腺癌细胞中，p8与肿瘤细胞的凋亡呈负相关[7]，其具体功能不详，而且p8可以作为一种潜在的药物靶点抑制肿瘤细胞的生长和转移。本实验针对p8进行亚克隆，通过缺陷病毒体外产生分泌蛋白，用于体外结合蛋白分子的鉴定，为研究p8的生物学功能提供实验工具。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 CO2培养箱（Thermo），蛋白质电泳仪器（Bio-Rad），倒置荧光显微镜（上海长方光学仪器厂），低温高速离心机（Eppendorf）。细胞系与培养条件：慢病毒包装细胞Fx细胞来自本实验室，细胞在37℃、5%CO2、饱和湿度下用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养。质粒pDisplay（Invitrogen，V660-20），慢病毒包装系统来自本实验室。限制性内切酶来自New England Biolabs Inc.，E.coli DH5α和质粒提取试剂盒购于原平皓试剂有限公司。DMEM培养液、胎牛血清和胰蛋白酶源于Hyclone，引物购自Invitrogen，鼠源抗Flag抗体购自Sigma-Aldrich，辣根过氧化物酶耦联的羊抗鼠抗体购自 Jackson Lab，底物 Chemiluminescent HRP substrate购自Millipore，其它实验试剂购自Sigma-Aldrich。

1.2 缺失HA和Myc表达序列的pDisplay质粒的构建及鉴定 载体pDisplay含有Igκ信号肽Hemagglutinin A，HA-Myc-PDGFR跨膜结构域组分，多克隆位点含 BglⅡ，SmaⅠ，PstI和 SalI，以此载体为模板，以pdis501SmaⅠ-SalⅠ和pdis301SmaⅠ-BglⅡ为引物（引物序列见表1）利用模板中的回文结构使引物与模板进行不对等配对来进行扩增，去除HA-Myc标记，产物大小约为5.3 kb，PCR产物经限制性内切酶SmaⅠ和PstⅠ酶切后连接，并转化感受态大肠杆菌DH5α，以菌落PCR鉴定并筛选阳性克隆，提取质粒，以限制性内切酶SmaⅠ和PstⅠ酶切鉴定并经DNA序列测定进一步验证，正确的克隆命名为pDisplay-SS。

1.3 pDisplay-SS-disF质粒的构建及鉴定 寡核苷酸dis-F51和dis-F31的退火产物（含凝血因子Xa识别位点IEGR和Flag标记序列DYKDDDDK，Xa-Flag）构建入缺失pDisplay-SS质粒的SmaⅠ-SalⅠ酶切位点之间，构建的质粒命名为pDisplay-SS-disF，转化与1.2相同，质粒提取，通过测序进行验证。

1.4 pDis-SS-disF-p8质粒的构建及鉴定 以p8-503 BglⅡ和p8-303 SmaⅠ为引物（引物序列见表1），以小细胞肺癌细胞H69总RNA的反转录产物为模板扩增p8cDNA序列，将p8cDNA构建入pDis-SS-disF质粒的SmaⅠ和BglⅡ酶切位点之间，构建的质粒命名为pDis-SS-disF-p8，转化与1.2相同，质粒提取，通过测序进行验证。

1.5 305-p8质粒的构建及鉴定 以Dis35和Dis55为引物（引物序列见表1），pDis-SS-disF-p8为模板进行PCR扩增，PCR产物构建入305质粒（含有IRES-GFP片段）的两个BamH I酶切位点之间，构建的质粒命名为305-p8，转化与1.2相同，质粒提取，通过测序进行验证。

1.6 305-p8慢病毒的包装和分泌型融合蛋白p8的产生 利用Millipore的磷酸钙转染试剂盒，将构建好的305-p8与pMDL、Rev和VSVG 3个慢病毒包装质粒共转染入Fx293细胞，具体操作按Millipore的磷酸钙转染试剂盒说明书进行。转染24 h后更换培养基，继续培养且以后每24 h用0.22 μm的滤膜过滤收1次病毒上清液，除去细胞碎片，并加入 8 μg/mL的 polybrene，于-80℃冻存，连收 3次。转染48 h后利用荧光显微镜观察细胞是否表达GFP，如果表达说明转染成功，用Western blot检测表达的效果。

表1 实验用到的寡核苷酸序列Tab 1 The oligonucleotide sequences in the experiment

2 结果

2.1 缺失HA和Myc标记序列的pDisplay-SS质粒的构建 以dis501SmaⅠ-SalⅠ和dis301SmaⅠ-BglⅡ为引物扩增质粒pDisplay，产物大小约为5.3 kb（图1），经SmaⅠ和PstⅠ酶切后连接、转化，并提取质粒，经SmaⅠ和PstⅠ分别酶切及测序证实成功构建了缺失HA和Myc标记序列的pDisplay-SS质粒。

图1 pDisplay-SS质粒PCR产物的电泳结果Fig 1 Detection of pDisplay-SS PCR product by agarose gel electrophoresis

2.2 成功构建pDis-SS-disF质粒 将Xa-Flag序列构建入缺失HA和Myc表达序列的pDisplay-SS质粒，并经测序证明Xa-Flag序列无突变，成功构建pDis-SS-disF质粒。

2.3 pDis-SS-disF-p8质粒的构建 由dis-F51和dis-F31的退火产物（含Xa-Flag）构建入pDisplay-SS质粒的SmaⅠ-SalⅠ酶切位点之间，得到pDis-SS-disF；以p8-503 BglⅡ和p8-303 SmaⅠ为引物，扩增得到p8cDNA序列，将其构建入pDis-SS-disF质粒得到pDis-SS-disF-p8，经SalⅠ和BglⅡ酶切鉴定克隆成功（图2）；以Dis35和Dis55为引物，pDis-SS-disF-p8为模板，扩增产物构建入305质粒的BamH I位点，测序证实p8序列无突变。

图2 SalⅠ和BglⅡ双酶切鉴定pDis-SS-disF-p8质粒电泳图Fig 2 Agarose electrophoresis detection of pDis-SS-disF-p8plasmid digested by BglⅡ and SalⅠ

2.4 产生Igκ信号肽-p8-Xa-Flag-PDGFR跨膜结构域的融合蛋白 将上述构建的Igκ信号肽-p8-Xa-Flag-PDGFR跨膜结构域在305慢病毒载体中产生病毒，转染到Fx细胞内，24 h后荧光显微镜下观察显示转染效率达80%以上，收集蛋白，并用Anti-Flag抗体检测（图3），细胞内确实产生了融合蛋白。

图3 Anti-Flag Western blot检测融合蛋白的表达Fig 3 Anti-Flag Western blot detection of p8 fusion protein expression

3 讨论

本实验利用PCR诱变的方法去除pDisplay质粒中的HA和Myc标记序列随后顺序将Xa识别位点、Flag标记序列与p8表达序列构建入pDisplay质粒，最终通过将Igk信号肽-p8-Xa-Flag-PDGFR跨膜结构域构建入30′慢病毒载体，成功获得了p8的超表达载体，以用于p8基因的真核表达。随后通过慢病毒介导的外源基因载体感染Fx293细胞超表达p8融合蛋白，通过Western blot确证了外源融合蛋白的表达，这为在动物体内表达外源分泌蛋白奠定了实验基础。此外，对于体外分离和鉴定与融合蛋白结合的蛋白分子，我们可以采用凝血因子Xa的酶切识别位点及鉴定的方法，将结合的蛋白分子通过蛋白质质谱来鉴定，建立p8表达的方法有助于p8的功能深入研究。

［1］Ree A H,Pacheco M M,Tvermyr M,et al.Expression of a novel factor,com1,in early tumor progression of breast cancer[J].Clin Cancer Rev,2000,6（5）:1778

［2］Ree A H,Tvermyr M,Engebraaten O,et al.Expression of a novel factor in human breast cancer cells with metastatic potential[J].Cancer Res,1999,59（18）:4675

［3］Chowdhury U R,Smaant R S,Fodstad O,et al.Emerging role of nuclear protein 1（NUPR1）in cancer biology[J].Cancer Metastasis Rev,2009,28（1/2）:225

［4］Jiang W G,Davies G,Martin T A,et al.Com-1/p8 acts as a putative tumor suppressor in prostate cancer[J].Int J Mol Med,2006,18（5）:981

［5］JiangWG,DaviesG,KynastonH,etal.Does the PGC-1/PPARgamma pathway play a role in Com-1/p8 mediated cell growth inhibition inprostatecancer[J].MolMed,2006,18（6）:1169

［6］Salazar M,Carracedo A,Salanueva I J,et al.Cannabinoid action induces autophagy-mediated cell death through stimulation of ER stress in human glioma cells[J].Clin Invest,2009,119（5）:1359

［7］Su S B,Motoo Y,Iovanna J L,et al.Overexpression of p8 is inversely correlated with apoptosis in pancreatic cancer[J].Clin Cancer Res,2001,7（5）:1320