VDR基因FokⅠ多态性与不同严重程度前列腺炎发生的关联性分析

阮 黎，华 兴，李正明

（1.广东省广州市红十字会医院，暨南大学医学院附属广州红十字会医院泌尿外科，广东 广州 510220，2.广东省广州市红十字会医院病理科，广东 广州 510220）

VDR基因FokⅠ多态性与不同严重程度前列腺炎发生的关联性分析

阮 黎1，华 兴2，李正明1

（1.广东省广州市红十字会医院，暨南大学医学院附属广州红十字会医院泌尿外科，广东 广州 510220，2.广东省广州市红十字会医院病理科，广东 广州 510220）

目的：研究维生素D受体（VDR）基因启动子FokⅠ单核苷酸多态性（SNP）与不同严重程度前列腺炎（HP）的关联性，探讨遗传学因素在HP发病中的作用。方法：选择169例良性前列腺增生（BPH）并发HP患者，采用常规病理学检查将患者分为轻度组79例，中度组52例，重度组38例，应用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCR－RFLP）法进行FokⅠSNP检测，分析3组患者基因型和等位基因频数分布情况。结果：轻、中度HP患者FokⅠ位点3种基因型分布符合Hardy－Weinberg平衡定律（P＞0.05），重度HP患者中FokⅠ位点3种基因型的分布不符合Hardy－Weinberg平衡定律（P＜0.05）。FF、Ff和ff基因型在轻度和中度HP患者的分布为32%（25／79），46%（36／79）；22%（18／79），23%（12／52）；40%（21／52），37%（19／52）；组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。F基因频率在轻度和中度 HP患者组分别为54%（86／158）和43%（45／104），f基因频率在2组间分别为46%（72／158）和57%（59／104），组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：VDR基因FokⅠSNP可能与不同严重程度HP发生无关联。

组织学前列腺炎；单核苷酸多态性；维生素D受体

维生素D是一种多种生物效应的激素类载体，通过维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）发挥生理作用［1］。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是一种常见的遗传学类型。国外研究［2］发现：基因SNP与组织学前列腺炎（histological prostatitis，HP）的发生有一定的关联性。而VDR基因与HP的发生也有一定的关联性［3］，VDR基因启动子上存在FokⅠ位点SNP。本文作者前期研究［4］发现：VDR基因FokⅠ位点SNP与HP的发生有一定的关联性，而SNP作为遗传因素在导致不同严重程度非特异性炎症的发生中有不同的作用［5］。目前尚未见VDR基因SNP与不同严重程度HP关联性的报道。本研究主要分析VDR基因FokⅠ位点SNP与不同严重程度HP发生的关联性，从而探讨遗传学因素在HP发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2008年8月—2011年12月在本院泌尿外科治疗的良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）并发HP患者169例，按照病理检查结果分为轻度组79例，中度组52例，重度组38例。HP的诊断标准：以国际HP组织学分类诊断标准［6］为依据。轻度：前列腺组织中出现散在的炎性细胞浸润；中度：前列腺组织中出现炎性细胞的聚集，但不伴有腺体上皮组织的破坏或淋巴样小结形成；重度：前列腺组织中出现炎性细胞的聚集，同时伴有腺体上皮组织的破坏或淋巴样小结形成。3组患者的年龄［（73.9±2.7）岁、（73.6±2.7）岁、（74.1±2.1）岁］差异无统计学意义（P＞0.05）。其中重度组与轻度组前列腺体积［（42.4±2.7）mL、（41.5±5.2）mL］和前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）的表 达 水 平 ［（3.0±0.7）μg· L－1、 （2.6±0.9）μg·L－1］差异有统计学意义（P＜0.05）。3组患者最大尿流率［（10.1±1.5）mL·s－1、（9.7±2.0）mL·s－1、（9.1±0.7）mL·s－1］差异无统计学意义（P＞0.05）。所有患者前列腺标本均为经尿道前列腺电切（TURP）获得。本研究经本院伦理委员会批准，参试者均签署知情同意书。病理检查均经过2名病理医师确诊。

1.2 主要试剂及仪器 无水乙醇、高速离心机（Eppendorf公司，德国）；PCR仪（ABI公司，美国）；凝胶成像分析系统（Syngene公司，美国）。

1.3 DNA的提取 抽取研究对象肘静脉血2mL，经EDTA抗凝，采用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒（深圳晶美公司）提取基因组。

1.4 PCR扩增 通过GenBank检索到VDR基因序列［gi：29745161］，Genefisher设计引物：上游，5′－ACTGACTCTGGCTCTGAC－3′； 下 游， 5′－CACCTTGCTTCTTCTCCC－3′，引物合成由深圳晶美公司完成。扩增VDR包含起始密码FokⅠ的DNA片段，预期产物片段长度为246bp。PCR反应体系：反应总体积为50μL，含2μL模板DNA，8μL上、下游引物，2μL dNTPs，0.7μL Taq DNA聚合酶和相应的缓冲液。反应条件为：预变性96℃、8min；94℃、45s，52℃、60s，72℃、30s，共40个循环；72℃延伸10min。

1.5 聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCRRFLP）分析 对起始密码多态位进行PCR扩增后，取10μL PCR产物加入限制性内切酶FokⅠ（深圳晶美公司）0.5μL和10×buffer 1μL，牛血清白蛋白1μL，DNA 7.5μL，总反应体系为20μL，37℃过夜，采用2%琼脂糖凝胶对酶切产物行电泳分析，自动凝胶成像仪成像，检测基因型。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。VDR基因型频数分布组间比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1 基因型的PCR－RFLP分析 目的片段产物经FokⅠ 酶切后，检测到3种基因型：①等位基因上存在2个酶切位点的ff基因型，电泳显示为199bp和59bp 2条带；②无酶切位点的FF基因型，电泳显示为246bp 1条带；③有1个酶切位点的Ff基因型，电泳显示为246、199和59bp 3个条带。见图1。

2.2 不同严重程度HP患者VDR基因FokⅠ位点基因型频数分布 轻度和中度HP患者FokⅠ位点等位基因频数分布均符合Hardy－Weinberg平衡定律，说明在遗传学上轻度和中度HP患者具有代表性；重度HP患者FokⅠ位点等位基因频数分布不符合Hardy－Weinberg平衡定律，说明重度HP患者不具有遗传代表性，不能纳入分析。见表1。

2.3 轻度和中度HP患者中3种基因型频数分布的差异 FF、Ff和ff基因型及等位基因F和f在轻度组与中度组之间的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。提示FokⅠ位点SNP与HP的严重程度无关联性。见表2。

图1 VDR基因经FokⅠ酶切后的PCR－RFLP电泳图Fig.1 Electrophoregram of PCR－RFLP results of VDR gene digested by FokⅠ

表1 各组FokⅠ位点基因型频数的分布Tab.1 The distribution of genotypic frequency of FokⅠsite in various groups

表2 轻度与中度HP组患者FokⅠ位点基因型和等位基因频数分布Tab.2 The distribution of genotypic and allelic frequencies of FokⅠsite of patients in mild and moderate HP groups［n（η／%））

3 讨 论

HP的发病原因未完全阐明，HP对BPH的影响亦不明确。目前有研究［7－8］发现：HP与BPH以及前列腺癌的发生和进展有一定的关联性。因此，有必要对HP的发生发展进行进一步研究。

VDR是介导1，25（OH）2D3发挥生物效应的核受体，为核受体超家族的成员之一。VDR在本质上是一种配体依赖性的核转录因子。目前已经发现的VDR基因上存在的与疾病发生有关的基因多态性位点有BsmⅠ、TaqⅠ和FokⅠ等酶切位点［9］。以往主要研究这些多态性位点与肠癌［10］、乳腺癌［11］和基底细胞癌［12］等恶性肿瘤之间的关联性，目前研究［13－15］发现：这些位点与特异性炎症如结核或非特异性炎症均有一定的关联性，从而导致疾病的不同转归。

本研究采用PCR－RFLP方法检测了VDR基因启动子上存在的FokⅠ位点的SNP与不同严重程度HP发生之间的关系。虽然VDR基因启动子上存在的FokⅠ位点SNP与BPH并发HP有关联性，但本研究结果显示：轻度与中度HP患者3种基因型的频数分布差异无统计学意义，VDR基因启动子上FokⅠ位点SNP可能与不同严重程度HP的发生无一定的关联性，说明该位点SNP对前列腺组织中炎症反应的影响程度无差异性。

目前关于HP的发生与VDR基因SNP的关联性报道较少。本课题研究结果虽然显示VDR基因启动子上存在的FokⅠ位点SNP与轻度和中度HP的发生可能无关联性，而且重度HP的样本不符合Hardy－Weinberg平衡定律，但这只是初步结果，需要更大样本量和在不同人群中进行更加广泛的研究，并进行多位点SNP的联合分析，确定不同SNP位点的相互干扰作用以及意义，才能得出更完善的结论。

［1］Medeiros R，Monais A，Vasconcelos A，et al.The role of vitamin D receptor gene polymorphisms in the susceptibility to prostate cancer of a southern European population ［J］.J Hum Genet，2002，47 （8）：413－418.

［2］Fesinmeyer MD，Kwon EM，Fu R，et al.Genetic variation in RNASEL and risk for prostate cancer in a population－based case－control study ［J］.Prostate，2011，71 （14）：1538－1547.

［3］Fibbi B，Penna G，Morelli A，et al.Chronic inflammation in the pathogenesis of benign prostatic hyperplasia ［J］.Int J Androl，2010，33 （3）：475－488.

［4］阮 黎，钟惟德，李正明，等.维生素D受体基因FokⅠ多态性与良性前列腺增生合并组织学前列腺炎的关系 ［J］.中华男科学杂志，2011，17 （10）：880－883.

［5］Marcil V，Sinnett D，Seidman E，et al.Association between genetic variants in the HNF4Agene and childhood－onset Crohn’s disease ［J］.Genes Immun，2012，13 （7）：556－565.

［6］张祥华，张 骞，李学松，等.良性前列腺增生合并组织学前列腺炎的检出率－－两种不同诊断标准的比较研究 ［J］.中华临床医师杂志：电子版，2007，12 （7）：34－36.

［7］van Vuuren SP，Heyns CF，Zarrabi AD.Significance of histological prostatitis in patients with urinary retention and underlying benign prostatic hyperplasia or adenocarcinoma of the prostate ［J］.BJU Int，2012，109 （8）：1194－1197.

［8］Edlin RS，Heyns CF，van Vuuren SP，et al.Prevalence of histological prostatitis in men with benign prostatic hyperplasia or adenocarcinoma of the prostate presenting without urinary retention ［J］.S Afr J Surg，2012，50 （4）：127－130.

［9］Bid HK，Chaudhary H，Mittal RD.Association of vitamin－D and calcitonin receptor gene polymorphism in pediatric nephrolithiasis［J］.Pediatr Nephrol，2005，20 （6）：773－776.

［10］Bentley RW，Keown DA，Gearry RB，et al.Vitamin D receptor polymorphisms in colorectal cancer in New Zealand：an association study ［J］.N Z Med J，2012，125 （1356）：47－51.

［11］Engel LS，Orlow I，Sima CS，et al.Vitamin D receptor gene haplotypes and polymorphisms and risk of breast cancer：a nested case－control study ［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2012，21 （10）：1856－1867.

［12］Jorgensen TJ， Ruczinski I， Yao Shugart Y，et al.A population－based study of hedgehog pathway gene variants in relation to the dual risk of basal cell carcinoma plus another cancer［J］.Cancer Epidemiol，2012，36 （5）：288－293.

［13］刘轾彬，郑瑞娟，肖和平，等.汉族459例结核病易感基因多态性与临床特征的相关性 ［J］.中华结核和呼吸杂志，2011，34 （12）：923－928.

［14］Martelli FS，Mengoni A，Martelli M，et al.VDR TaqI polymorphism is associated with chronic periodontitis in Italian population ［J］.Arch Oral Biol，2011，56 （12）：1494－1498.

［15］Pillai DK，Iqbal SF，Benton AS，et al. Associations between genetic variants in vitamin D metabolism and asthma characteristics in young African Americans：apilot study ［J］.J Investig Med，2011，59 （6）：938－946.

Association analysis between vitamin D receptor gene polymorphism and occurrence of different degrees of histological prostatitis

RUAN Li1，HUA Xing2，LI Zheng－ming1
（1.Department of Urinary Surgery，Affiliated Guangzhou Red Cross Hospital，School of Medical Science，Jinan University，Guangzhou City Red Cross Hospital of Guangdong Province，Guangzhou 510220，China；2.Department of Pathology，Guangzhou Red Cross Hospital，Guangdong Prvince，Guangzhou 510220，China）

Objective To investigate the association between single nucleotide polymorphism （SNP）of FokⅠin vitamin D receptor（VDR）gene and different degrees of histological prostatitis（HP），and to discuss the role of genetic factors in the onset of HP.Methods 169patients with benign prostatic hyperplasia（BPH）complicated with HP were selected.The mild（79cases），moderate（52cases）and severe（38cases）HP patients were distinguished by pathological examination.Polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism（PCR－RFLP）was used to determine the SNP of Fok Ⅰ of patients.The distribution of genotypic and allelic frequencies of the patients in various groups was analyzed.Results The distribution of genotypic frequency of FokⅠsite in mild and moderate HP patients didn’t deviate from Hardy－Weinberg equilibrium（P＞0.05）.The distribution of genotypic frequency of FokⅠgene in severe HP patients deviated from Hardy－Weinberg equilibrium（P＜0.05）.The distribution of FF，Ff，ff genotypes in mild and moderate HP patients were 32%（25／79），46%（36／79）；22% （18／79），23% （12／52）；40% （21／52），37% （19／52），respectively；there was no significant difference between two groups（P＞0.05）.The allelic frequencies of F and f were 54%（86／158），46%（72／158）in mild HP patients and 43% （45／104），57% （59／104）in moderate HP patients，respectively；there was no significant difference between two groups（P＞0.05）.Conclusion VDR gene FokⅠ SNP may not associate with the occurrence of different degrees of HP.

histological prostatitis；single nucleotide polymorphism；vitamin D receptor

R588

A

1671－587Ⅹ（2013）03－0570－04

10.7694／jldxyxb20130330

2012－10－19

国家自然科学基金面上项目资助课题 （81272849）

阮 黎 （1978－），男，湖北省荆门市人，副主任医师，医学博士，主要从事泌尿男科基础和临床研究。

阮 黎 （Tel：020－34403797，E－mail：ruanli1978＠126.com）