人p21活化激酶6基因截短区域的GST标签原核表达质粒的构建及其重组蛋白的表达

刘 彤，李 洋，李丹妮，耿楠希，李 丰

（中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室 教育部医学细胞生物学重点实验室，辽宁 沈阳 110001）

人p21活化激酶6基因截短区域的GST标签原核表达质粒的构建及其重组蛋白的表达

刘 彤，李 洋，李丹妮＊，耿楠希，李 丰

（中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室 教育部医学细胞生物学重点实验室，辽宁 沈阳 110001）

目的：构建人p21活化激酶6（PAK6）的各个截短区域原核表达质粒，并诱导和鉴定其融合蛋白的表达，为探讨PAK6基因的生物学功能提供依据。方法：以真核表达质粒pcDNA3.1－GFP－PAK6为模板，PCR扩增出PAK6基因的各个截短片段。所获得的各截短片段经EcoRⅠ／XhoⅠ双酶切后克隆至GST标签的原核表达载体pGEX－5X－1中。将构建的PAK6各截短质粒转化入E.coliBL21中，采用IPTG诱导PAK6基因截短融合蛋白表达，采用Western blotting法鉴定PAK6基因截短融合蛋白的表达。结果：EcoRⅠ／XhoⅠ双酶切后得到与预期大小相符的载体片段（5 000bp）和PAK6 1－55（165bp）、PAK6 56－210（465bp）、PAK6 211－410（600bp）及PAK6 385－681（891bp）4个片段。Western blotting检测，PAK6各截短区域质粒GST－PAK6截短融合蛋白相对分子质量分别为32 000、43 000、48 000和60 000。结论：成功构建PAK6基因各个截短区域GST标签原核表达质粒并表达其重组蛋白。

P21活化激酶；截短区域；原核表达质粒；GST融合蛋白

人p21活化激酶 （p21－activated kinase，PAK）是保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，PAK为Rho家族小鸟苷三磷酸酶（Rho－GTPase）Cdc42／Rac1下游重要的靶蛋白，参与许多重要的细胞活动，如细胞骨架重建、细胞移动／迁移、细胞凋亡与生存和细胞周期与有丝分裂，而且与肿瘤细胞的侵袭转移密切关联［1－3］。PAK家族有6个成员，第1亚类包括PAK1～3，第2亚类包括PAK4～6。第1亚类成员含有自我抑制域，其激活依赖于上游Rho－GTPase，而第2亚类成员不含有自我抑制域，表达后具有持续的激酶活性［4－5］。PAK6为第2亚类PAK家族的成员之一，是雄激素受体的配体结合域上的氨基酸序列629～919通过酵母双杂交识别筛选出来的雄激素受体关联蛋白，主要表达于前列腺、睾丸和大脑等器官［6］。PAK6基因总长为2 055bp，编码681个氨基酸，蛋白相对分子质量为75 000，N－端为高度保守的Rac／Cdc42相互作用结合域（CRIB），C－端是激酶域。文献［7］报道：PAK6能够同时与雄激素受体和雌激素受体相互作用，提示PAK6与激素类受体的生理学功能有关联。PAK6在前列腺癌组织中呈现高表达，尤其是在雄激素非依赖的情况下PAK6过表达尤为明显［8］，说明PAK6在前列腺癌的恶性进程中具有重要的作用。PAK6能够磷酸化雄激素受体的DNA结合结构域，并以激酶依赖性方式抑制雄激素受体的转录激活作用［9］。本研究按照PAK6基因不同区域的结构特点构建PAK6基因各个截短区域的原核表达质粒，并诱导其GST标签融合蛋白的表达，进一步寻找与其特定区域相互结合的蛋白，为探讨PAK6的生物学功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 pcDNA3.1－GFP－PAK6为美国Scripps研究院Bokoch惠赠；大肠杆菌BL－21感受态细胞、GST标签原核表达载体pGEX－5X－1购自美国Amersham Biosciences公司，GST单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司，PAK6商品化激酶购自美国Invitrogen公司，Glutathione SepharoseTM4B购自美国GE Healthcare公司，限制性内切酶、PyrobestTMDNA polymerase、电泳凝胶回收试剂盒购自大连Takara公司，蛋白相对分子质量标准购自美国MBI公司，DNA相对分子质量标准购自美国Takara公司，T4DNA连接酶购自英国NEB公司。引物序列合成和DNA序列测定由南京金斯瑞有限公司完成。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 PAK6基因截短区域原核表达质粒的构建利用Primer Premier 5.0引物设计软件设计引物，分别在上游引物中引入EcoRⅠ酶切位点，在下游引物中引入XhoⅠ酶切位点。以pcDNA3.1－GFPPAK6质粒为模板，利用PyrobestTMDNA polymerase和引物进行PCR扩增，获得PAK6基因的截短片段，截短片段分别是1～55、56～210、211～410和385～681位氨基酸。将扩增的截短片段利用EcoRⅠ／XhoⅠ酶切后连接到经同样酶切的pGEX－5X－1原核表达载体中。质粒经测序鉴定证实构建成功。构建成功的质粒命名为pGEX－5X－1－PAK6 1－55、pGEX－5X－1－PAK6 56－210、pGEX－5X－1－PAK6 211－410 和 pGEX－5X－1－PAK6 385－681。见表1。

表1 PAK6基因截短突变体引物序列Tab.1 The sequences of primers of truncated mutants of PAK6gene

1.3 PAK6基因截短区域重组表达蛋白的诱导和纯化 将构建成功的 pGEX－5X－1－PAK6 1～55、pGEX－5X－1－PAK6 56～ 210、pGEX－5X－1－PAK6 211～410 和 pGEX－5X－1－PAK6 385～681截短质粒转化至大肠杆菌BL21中，加入1mmol·L－1IPTG，于30℃条件下振荡培养3h，诱导GSTPAK6截短蛋白的表达。诱导后的细菌以4℃、6 000×g离心15min以沉淀细菌，加入1×SDS Loading buffer，重悬煮沸裂解；采用12%SDSPAGE电泳检测GST－PAK6截短蛋白的表达。

1.4 Western blotting法鉴定重组蛋白的表达 将上述诱导表达后的蛋白经12%SDS－PAGE凝胶分离后，恒流0.09mA转移至PVDF膜上，4℃过夜，用5%脱脂奶粉封闭3h，TBST洗膜15min×3次，加入GST抗体（1∶1 000），室温孵育1h，TBST洗膜15min×3次，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）室温孵育1h，TBST洗膜15min×3次，增强化学发光法（ECL）显色结果以是否出现特定蛋白条带判定重组蛋白的表达。

2 结 果

2.1 PAK6基因截短区域原核表达质粒的构建和鉴定结果 PAK6基因1～55、56～210、211～410和385～681位氨基酸碱基片段长度分别为165、465、600 和 891bp。pGEX－5X－1－PAK6 1－55、pGEX－5X－1－PAK6 56－210、pGEX－5X－1－PAK6 211－410和 pGEX－5X－1－PAK6 385－681这4个表达质粒经EcoRⅠ／XhoⅠ酶切后得到长度为5 000bp的载体片段，与预期大小相符，证明质粒构建成功（图1）。

2.2 PAK6基因截短区域原核表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达 将构建的原核表达质粒pGEX－5X－1－PAK6 1－55、 pGEX－5X－1－PAK6 56－210、pGEX－5X－1－PAK6 211－410 和 pGEX－5X－1－PAK6 385－681分别转化至大肠杆菌BL21中。GST标签的蛋白相对分子质量为26 000，与GST标签融合后1～55、56～210、211～410和385～681区域分别出现相对分子质量为32 000、43 000、48 000和60 000左右的特异蛋白表达条带，与预期结果一致。见图2。

2.3 PAK6基因截短融合蛋白的Western blotting鉴定 在相对分子质量为32 000、43 000、48 000和60 000位置可见特异性结合抗体的条带表达，说明成功表达了融合蛋白GST－PAK6 1－55、GSTPAK6 56－210、GST－PAK6 211－410和 GST－PAK6 385－681，与预期结果一致。见图3。

图1 PAK6基因4个截短区域的原核表达质粒酶切电泳图Fig.1 Electrophoregram of enzyme digestion of prokaryotic expression plasmids of four truncated regions of PAK6gene

图2 PAK6基因4个截短区域原核表达质粒在大肠杆菌BL21中表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expressions of prokaryotic expression plasmids of four truncated regions of PAK6gene in E.coli BL21

图3 Western blotting法鉴定GST－PAK6截短融合蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressions of GST－PAK6 truncated fusion proteins detected by Western blotting method

3 讨 论

PAK6基因是PAK家族中最晚发现的一个成员，其生物学功能并未像家族其他成员一样研究的比较详尽。目前，PAK6基因的主要功能是与雄激素受体相互作用并通过磷酸化调节雄激素受体的转录活性［6－7］。在前列腺、睾丸和大脑中PAK6基因表达水平较高，并且在前列腺癌，尤其是雄激素去势治疗后的复发性前列腺癌中呈高表达［8］。过度表达并维系PAK6激酶活性可降低肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性，导致前列腺癌发病和发生激素非依赖 性 的 改 变［10－11］。 最 新 的 研 究［12］表 明：PAK6在正常生理情况下通过磷酸化雄激素受体和肿瘤E3连接酶Mdm2以泛素化途径降解雄激素受体以维持其稳态，从而负向调节前列腺肿瘤的生长。上述研究提示PAK6基因在恶性前列腺癌尤其是复发性前列腺癌中是一个具有重要治疗意义的分子靶位。此外，动物实验中，PAK6基因敲除鼠虽未表现出胚胎致死的症状，但其与裸鼠的体质量增长有密切的关联［13］；PAK6基因也在小鼠的学习记忆能力方面起重要作用［14］。研究提示PAK6基因具有重要的生理学作用。

本研究根据PAK6基因序列特点分成4个截短区域，其中1～55区域氨基酸包含CRIB区域，其中可能包含有核定位相关的信号序列［15－16］。56～210区域氨基酸为PAK6N端的调节区域，而211～410区域氨基酸为铰链结构域，许多与PAK6基因相互作用的蛋白都可能结合至该结构域中。385～681区域氨基酸包含PAK6功能结构域即激酶结构域。不同的PAK6相互作用蛋白可能结合于PAK6基因不同区域，因此构建PAK6基因截短区域的表达质粒可用于筛选相互作用蛋白并研究其特定功能。本研究为进一步鉴定PAK6基因的生理学功能提供了可能的依据。

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＊中国医科大学临床医学七年制94期

Construction of GST－tagged prokaryotic expression plasmids of human PAK6gene and expressions of their recombinant proteins

LIU Tong，LI Yang，LI Dan－ni＊，GENG Nan－xi，LI Feng
（Department of Cell Biology，School of Basic Science，Key Laboratory of Medical Cell Biology，Ministry of Education，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To construct the prokaryotic expression plasmids of truncated regions of human p21－activated kinase 6（PAK6）to induce and identify their recombinant proteins，and to provide basis for discussing the biological function of PAK6gene.Methods The eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1－GFP－PAK6was used as the template，and the truncated segments of PAK6gene were amplified by PCR method.The truncated segments were cloned into GST－tagged prokaryotic expression vector pGEX－5X－1after double enzyme digestion ofEcoRⅠ／XhoⅠ.The truncated plasmids were transfected intoE.coliBL21and the PAK6gene truncated fusion proteins were induced by IPTG and verified by Western blotting method.Results The vector fragment（5 000bp）and PAK6 1－55（165bp），PAK6 56－210（465bp），PAK6 211－410（600bp），and PAK6 385－681（891bp）vector fragments being consistent with the expected fragments were obtained after double enzyme digestion ofEcoRⅠ／XhoⅠ.The Western blotting results showed that the relative molecular mass of GST－PAK6truncated fusion proteins of PAK6 truncated region plasmids were 32 000，43 000，48 000，and 60 000，respectively.Conclusion GST－tagged prokaryotic expression plasmids of different truncated regions of PAK6gene are constructed and their recombinant proteins are expressed successfully.

p21－activated kinase 6；truncated region；prokaryotic expression plasmid；GST fusion protein

R736

A

1671－587Ⅹ（2013）03－0437－04

10.7694／jldxyxb20130303

2013－03－12

国家自然科学基金资助课题 （31171360）

刘 彤 （1980－），女，辽宁省沈阳市人，讲师，医学博士，主要从事肿瘤信号转导方面的研究。

李 丰 （Tel：024－23261056，E－mail：fli＠mail.cmu.edu.cn）