FAK的基因多态性与冠心病的关系

王丽

[摘要] 目的 探讨粘着斑激酶的基因多态性与冠心病的关系。 方法 目前已知的FAK两个cSNP位点分别是C2564T和G3104T，它们编码的蛋白质分别由Pro，Gly转变成Ser，Cys。本研究采用基因多态性检测方法（PCR+RFLP）检测冠脉造影确诊的冠心病患者215例（男109例，女106例）及与其年龄，性别及体重指数相匹配的健康体检者168例（男86例，女82例）FAK的一个cSNP位点C2564T的基因型，探讨FAK的C2564T基因型与冠心病的关系。 结果 男性冠心病患者中FAK的C2564T基因型等位基因T和C与男性健康体检者中等位基因T和C比较差异有统计学意义（P<0.05）。女性冠心病患者与女性健康体检者两组比较亦差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 FAK的C2564T基因型可能与冠心病的发生有一定的关系。

[关键词] 粘着斑激酶；基因多态性；冠状动脉疾病

[中图分类号] R541.4 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）05-22-03

粘着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是Schaller等1992年发现的能使Src内源性蛋白酪氨酸激酶激活的主要底物，属于非受体蛋白酪氨酸激酶，它是整合素介导的平滑肌细胞迁移途径中信号转导通路的关键[1]。众所周知，血管平滑肌细胞（VSMC）的迁移和增殖在动脉粥样硬化斑块形成及血管成形术后再狭窄的发生过程中起着重要的作用。冠心病作为一种多基因疾病已成为疾病基因组学研究的重点。目前已知的FAK两个cSNP位点分别是C2564T和G3104T，它们编码的蛋白质分别由Pro，Gly转变成Ser，Cys[2]。因此本研究采用病例-對照设计及基因多态性检测（PCR+RFLP）的方法，检测FAKC2564T的基因型，旨在探讨其基因多态性与冠心病的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2011年5～10月在本院心血管内科就诊的冠状动脉造影阳性的冠心病患者共215例（冠心病组），男109例，女106例，年龄50～77岁，平均（61.9±10.6）岁。从同期健康体检者中选取年龄，体重指数（BMI）与患者相匹配的志愿者（对照组）168例，男86例，女82例，年龄50～78岁，平均（63.3±6.3）岁，均无急慢性肝病、高血压、冠心病、糖尿病、肥胖等疾病。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽取 空腹12 h后，取肘静脉血1 mL EDTA抗凝，用DNA抽取试剂盒从150μL静脉血中提取DNA。

1.2.2 PCR扩增 10μL PCR反应体系含：基因组DNA 0.5 μg，上游和下游引物分别为20 pmol，dNTPs 0.25 mmol，Taq酶0.5μL，10Buffer缓冲液1μL，Mgcl2 2 mmol，去离子水补足10μL。引物序列分别为：上游引物：5AGCCCACAGCACATGGTACA3下游引物：5GCCAAGCCGACTTCCTTCA3（序列由上海博亚生物技术有限公司合成）。扩增条件：95℃预变性5 min后，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，循环32次，最后72℃延伸5 min。

1.2.3 限制性内切酶消化 PCR产物10μL，BglII 5 U，10Buffer 2μL，37℃消化5 h。

1.2.4 电泳 2%琼脂糖凝胶电泳，以100 bp的marker作为DNA片断大小的标准物，于100 V恒流下电泳15 min，0.5μg/mL溴化乙淀（EB）显色鉴定。

1.2.5 分析 FAK PCR产物片断总长度经特异性限制内切酶切割后，可出现三种片断大小的组合。等位基因频率计算：采用平衡法，C=CC+1/2CT；T=TT+1/2CT。

1.3 统计学处理

采用SPSS11.0统计软件，实验数据均以（）表示，进行x2检验分析。

2 结果

2.1 FAK基因的PCR产物酶切电泳图

PCR扩增产物为363 bp，取3个样本测序确认，其余经2%琼脂糖凝胶电泳确认后，取PCR产物10μL，10 Buffer 2μL，加限制性内切酶BglII 5 U于37℃消化5 h。在紫外灯下观察结果为：纯合子（TT）电泳图谱为363 bp一条带，纯合子（CC）电泳图谱为130 bp和233 bp两条带，杂合子（TC）电泳图谱为363 bp、130 bp和233 bp三条带。见图1。

1.DNA marker；2.纯合子（TT） 电泳图谱；

3.杂合子（TC）电泳图谱；4.纯合子（CC）电泳图谱

图1 FAK基因的PCR产物酶切电泳图

2.2 冠心病组和对照组的FAK C2564T基因型和等位基因频率分布

男性冠心病患者中FAK基因C2564T基因型等位基因T和C的频率分别为69.25%、30.75%；男性健康体检者等位基因T和C的频率分别为40.7%、59.3%，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

女性冠心病患者中FAK基因C2564T基因型等位基因T和C的频率分别为73.6%、26.4%；女性健康体检者等位基因T和C的频率分别为44.5%、55.5%，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 讨论

冠状动脉粥样硬化发生过程中一个重要环节是VSMC在多种细胞因子的刺激下迁移粘附和增殖，其分子基础是细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用。在正常血管壁中，VSMC通过与ECM相互作用保持其自身分化状态；在动脉粥样硬化、血管再狭窄发生过程中，可通过ECM的降解，合成及重新编排使VSMC发生重构。VSMC与ECM之间的相互作用是由ECM受体蛋白—整合素介导的，而FAK是整合素介导的信号转导通路中的关键，在ECM诱导的VSMC粘附迁移，增殖过程中发挥重要作用[3]。

单核苷酸多态性（SNP）为数众多，分布广泛，位于编码区SNP（cSNP）可引起蛋白质重要部位氨基酸变异，导致其功能改变，是基因组中决定人类表型多样性的核心信息。本研究结果显示，男性冠心病患者中FAK等位基因T和C与男性健康体检者中等位基因T和C比较有显著性差异（P<0.05）。女性冠心病患者与女性健康体检者两组比较差异亦有统计学意义（P<0.05）。

FAK是Schaller等1992年发现的能使Src内源性蛋白酪氨酸激酶激活的主要底物，是构成粘着斑的主要成分之一。FAK有6个磷酸化位点，Tyr397是自身磷酸化位点，可与Src相互作用，使体外FAK激酶的活性达到最大[4]。FAK是细胞内多条信号转导通路的交汇点，通过影响细胞内信号转导，对血管平滑肌细胞的迁移和增殖有一定的调控作用[5]。血管损伤后，中膜的VSMC向内膜迁移，FAK可通过激活多个下游信号，如Src家族，PTKs，PI3K，或与其他信号蛋白如GRB2结合，从而促进VSMC迁移[6]。2000年Christof等[7]发现FAK可以促使PDGF-BB激活ERK2，这是使VSMC发生趋化性迁移所必需的。Daniel等[8]在2003年发现的人类巨细胞病毒趋化因子受体U28诱导的VSMC迁移也是FAK介导的，但具体机制不详。同时Zhongbiao等[9-10]也提出了FAK在IL-6引起的肌动蛋白细胞骨架重排使VSMC迁移的过程中发挥了重要作用。VSMC是呈锚着依赖性生长的细胞，它的增殖在血管狭窄和再狭窄的发生中起着关键作用，它的增殖需要生长因子和ECM的共同刺激，而FAK同时参与二者介导的通路[11-12]。

本研究显示FAK的C2564T不同基因型可能与冠心病的发生有一定关系，但具体作用机制尚不清楚，有待进一步深入研究，从而为冠心病防治提供理论依据。

[参考文献]

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[8] Daniel N.S，Jennifer V，Patsy S.Human cytomegalovirus chemokine receptor US28-induced smooth muscle cell migration is mediated by focal adhesion kinase and Src[J].J Biol Chem，2003，278（50）：50456-50465.

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[11] Nico Ghilardi，Radek C，Skoda.The leptin receptor activates janus kinase2 and signals for proliferation in a factor-dependent cell line[J]. Molecular Endocrinology， 1997； 11（4）：393-399.

[12] Bodary PF，Westrick RJ，Wickenheiser KJ，et al. Effect of leptin on arterial thrombosis following vascular injury in mice[J].JAMA，2002，287：1706-1709.

（收稿日期：2013-01-07）