HPLC法测定四季三黄片中大黄素、大黄酚的含量

武晓红?敬永升?刘晓军

[摘要] 目的 采用高效液相法测定四季三黄片中大黄素、大黄酚的含量。 方法 用高效液相色谱检测法，Elite C18色谱柱，流动相为甲醇∶水（87∶13，pH=4.5），流速为 1.000 mL/min，检测波长254nm，柱温：室温。 结果 大黄素和大黄酚分别在10.1～50.5μg/mL和9.97～99.7μg/mL范围内线性关系良好，平均回收率分别为100.8%和100.2%。 结论 该方法简便、灵敏、可靠、准确、重现性好。

[关键词] 四季三黄片；大黄素；大黄酚；含量测定

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）06-96-03

四季三黄片由大黄、黄芩、栀子、黄柏四味药组成。该药消炎退热，通便利水，用于口鼻生疮，咽疼齿痛，口干舌燥，目眩头晕，大便秘结，小便赤黄[1]，具有消炎退热、通便利水的功效[2]，临床上主要用于口舌生疮、咽喉肿痛、头晕目眩等症[3]。其主要成分大黄为蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatum L）、唐古特大黄（Rheum tanguticum Maxim. Ex Balf）或药用大黄（Rheum officinale Bail）的干燥根及根茎。具有泻热通便、解毒消痈、行瘀通经、清热除湿之功效。临床用于胃肠实热积滞、大便秘结、腹部胀满、热毒疮疡、暴赤眼痛、口舌生疮、齿龈肿痛、湿热壅滞之黄疸、小便不利、大便干结等[4]。其中大黄素和大黄酚是大黄的主要有效成分[5]。目前测定大黄素和大黄酚含量的方法多为HPLC法，也有薄层扫描法。本研究采用HPLC法对四季三黄片中大黄的主要有效成分大黄素和大黄酚进行含量测定[6]。结果表明，使用该法测定时，其线性关系好、准确度高、稳定性好、专属性强、重复性好，可用于大黄素和大黄酚的质量控制方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

LC–10AT型高效液相色谱泵（日本岛津）；SPD–10A型紫外检测器（日本岛津）；N–2000双通道色谱工作站（浙江大学智达信息有限公司）；色谱柱Hypersil–ODS（4.6 mm×150 mm，5 ?m，大连依利特科学仪器有限公司）；AG135型电子天平（瑞士，梅特勒-托利多）；HS10260D型超声波清洗机（天津市恒奥科技发展有限公司）等。

1.2 试剂

大黄素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110756-200110）；大黄酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110796-200716）；四季三黄片（江西华太药业有限公司，批号：091039）；甲醇（一级色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司）；纯净水（乐百氏有限公司）；冰醋酸（分析纯，莱阳化工实验厂）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件选择

色谱柱：Hypersil-ODS柱（4.6 mm×150 mm，5?m）购自大连依利特公司，流动相：甲醇-水（87∶13），用醋酸调pH=4.50，流速：1.000 mL/min，检测波长：254 nm，柱温：室温，进样量：20?L。在此色谱条件下，得到大黄素、大黄酚对照品混合溶液的HPLC图谱（图1）及供试品溶液的HPLC图谱（图2）。

1.大黄素峰；2.大黄酚峰

1.大黄素；2 .大黄酚

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取大黄素对照品，大黄酚对照品适量，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，超声20 min，既得浓度为101.00μg/mL的大黄素对照品溶液和浓度为99.70μg/mL的大黄酚对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品的制备 取供试品10片，精密称量，去包衣，研细，精密称取0.9953 g于25 mL容量瓶中，加入甲醇适量，超声处理30 min，加甲醇至刻度，静置，滤过，取滤液摇匀既得供试品溶液，备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取2.2.1项下的大黄素对照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成每毫升含大黄素10.1、20.2、30.3、40.4、50.5μg的大黄素标准溶液，另精密吸取2.2.1项下的大黄酚对照品溶液1.00、3.00、5.00、7.00、10.00 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成每毫升含大黄酚9.97、29.9、49.9、69.8、99.7μg的大黄酚标准溶液。各取20 ?L注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图。每种浓度进样三次，取其3次峰面积平均值，结果见表1～2。以大黄素、大黄酚浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算出回归方程：大黄素Y=33 232X+233.72（r=0.9999）；大黄酚Y=41 442X+160 000（r=0.9997）。结果表明大黄素在10.1～50.5μg/mL范围内具有良好线性关系；大黄酚在9.97～99.7μg/mL范围内具有良好线性关系。

2.3.2 精密度实验 取线性关系项下的大黄素对照品溶液（50.5μg/mL）20 ?L，重复进样6次，依法测定，记录色谱图，平均峰面积为1675 125.333，RSD=0.91%（n=6）。取线性关系项下的大黄酚对照品溶液（49.9μg/mL）20 ?L，重复进样6次，依法测定，记录色谱图。平均峰面积为2 182 387.833，RSD=0.84%（n=6）。

2.3.3 稳定性实验 按2.2.2项下供试品制备方法制备1份样品溶液，分别在0、2、4、6、8、10 h进行测定，按上述色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图。大黄素和大黄酚的RSD分别为1.26%和0.67%。结果表明供试品溶液稳定性良好。

2.3.4 重复性实验 同一批样品6份取，按2.4含量测定项下方法配制样品溶液，取每份溶液20 ?L进样，记录色谱图，测定大黄素和大黄酚峰面积，计算大黄素RSD为0.83%，大黄酚RSD为0.91%。见表6。结果表明，该法重复性良好。

2.3.5 回收率实验 精密称取含量测定项下已知含量（大黄素0.2355 mg/片、大黄酚0.4007 mg/片）的供试品储备液（批号：091039）5.00 mL于10 mL容量瓶中，在此容量瓶中精密加入大黄素对照品储备液1.50 mL，大黄酚对照品储备液2.50 mL，用流动相稀释至刻度，摇匀，超声20 min，用0.45 ?m的滤膜过滤即得。进样6次，每次进20 ?L，记录色谱图，计算回收率。测得大黄素的回收率为100.8%，结果见表1；大黄酚的回收率为100.2%，结果见表2。

2.4 样品测定

按2.2.2项下供试品溶液的配制方法制备6份（3批）四季三黄片供试品溶液，分别用0.45 ?m滤膜滤过，取续滤液，按2.1项下色谱条件每份进样3次， 每次进样20?L，记录色谱图，测定峰面积，由峰面积根据回归方程计算大黄素、大黄酚的含量。结果见表3、4。

3 结论

市场三黄片的销售量很大，很多厂家生产的三黄片未按处方投料等存在质量问题，为了保证临床用药和个人用药的安全性和有效性。制备工艺的规范也非常重要，本实验采用HPLC法对四季三黄片中大黄素、大黄酚的含量进行测定。四季三黄片中大黄素、大黄酚的含量是主要质量标准，这项工作科学的评价该药品的质量，具有重要意义。实验表明其线性关系良好，稳定性及重复性均较好，精密度好、准确度高，可作为该产品含量测定的可靠方法。

[参考文献]

[1] 冯源，张德全，周浓，等.HPLC测定四季三黄片中5种蒽醌类衍生物的含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（7）：96-99.

[2] 冯看，杨黎.HPLC测定四季三黄片中大黄素和大黄酚的含量[J].广西中医学院学报，2008，11（2）：50-52.

[3] 郭洛宏.HPLC法测定三黄片中盐酸小檗碱、大黄素和大黄酚含量的结果分析[J].中国药房，2011，22（40）：3824-3826.

[4] 王洁，张嫱，张一鸣，等.超声提取合HPLC测定三黄片中大黄素和大黄酚的含量[J].辽宁中医药大学学报，2010，12（11）：62-64.

[5] 王洁，张一鸣，李进冉，等.市售三黄片中大黄素和大黄酚的含量测定及相关分析[J].河北理工大学学报2009，31（2）：93-99.

[6] 祝忠民，卢晓荣.HPLC法同时测定三黄片中4种成分的含量[J].西北药学杂志2008，23（5）：300-301.

（收稿日期：2013-01-21）