非小细胞肺癌血清MGMT、RASSF2、RUNX3及RASSF1A基因启动子CpG岛甲基化的联合检测及意义

赵培革?鲁德玕?姬晓青?赵琦?刘忠志?孙立红

[摘要] 目的 探讨非小细胞肺癌患者血清中人类O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）、RASSF2、人类Runt相关转录因子3、RAS相关区域家族1A基因启动子区域甲基化状况及其临床意义。 方法 基因测序法检测62例NSCLC患者（肺癌组）和30例肺部良性疾病患者和16例健康体检者（对照组）血清中MGMT、RASSF2、RUNX3、RASSF1A基因启动子区域甲基化状况，并分析目标基因启动子区域甲基化状况与临床特征的关系。 结果 肺癌组MGMT基因甲基化频率为27.42%（17/62），而对照组为0（0/46）（x2=14.97，P<0.01）；MGMT基因甲基化状态与年龄、性别、病理类型和分化状况无明显相关（P>0.05）。甲基化组吸烟指数（620.78±135.34）高于非甲基化组（498.96±150.87）（t=2.91，P<0.05）。MGMT基因甲基化多见于晚期患者，Ⅰ～Ⅱ期甲基化率为0（0/11）而Ⅲ～Ⅳ期为33.33%（17/51）（Fisher精确概率法，P<0.05）。肺癌组RASSF2基因甲基化频率为38.71%（24/62），而对照组为0（0/46）（x2=22.89，P<0.01）；NSCLC患者血清RASSF2基因甲基化检出率与年龄、性别、病理类型、临床分期、分化程度无明显相关（P>0.05），不吸烟者RASSF2甲基化率高于吸烟者（61.90% vs 26.83%，x2=7.20，P<0.05）。 结论 MGMT、RASSF2、RUNX3、RASSF1A等基因异常甲基化在NSCLC患者外周血中有较高的发生率。MGMT、RASSF2、RUNX3、RASSF1A等基因异常甲基化状态可能和患者临床资料有一定关系。MGMT、RASSF2、RUNX3、RASSF1A等基因异常甲基化可能在NSCLC发生、发展中起重要作用。MGMT、RASSF2、RUNX3、RASSF1A等基因异常甲基化状态有望成为NSCLC辅助诊断和预后判断的分子标记。

[关键词] 肺肿瘤；非小细胞；人类O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶；RASSF2；人类Runt相关转录因子3；RAS相关区域家族1A

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）06-20-05

在大肠癌、乳腺癌等肿瘤中，RASSF2经常发生甲基化。RAS相关区域家族1A（RAS association domainfamily 1A，RASSF1A）是RAS凋亡家族成员，定位于3p21.3[1]，该基因启动子CpG岛高甲基化造成的基因表达沉默在许多肿瘤中出现。本研究采用基因测序法（bisulfite genomic sequence）和（或）甲基化特异性聚合酶链反应法（methylation specificity polymerase chain reaction，MS-PCR）检测并比较62例NSCLC患者和30例肺部良性疾病患者和16例健康志愿者外周血清中MGMT、RASSF2、RUNX3、RASSF1A等基因的甲基化状态，比较目标基因的甲基化率与临床特征的关系，探讨其临床意义。为肺癌早期诊断、监测及预后判断及进一步早期治疗等提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2008年12月～2011年12月本院呼吸内科住院治疗的62例NSCLC患者为研究对象，其中男40例，女22例；年龄42～75岁，平均（59.6±6.5）岁。全部病例均经组织病理学或细胞学证实，所有患者均未行放、化疗。按病理形态学分类，鳞癌27例，腺癌35例，按分化程度分高分化13例，中分化17例，低分化和未分化32例，按2003年国际抗癌联盟制订的TNM分期法进行分期TNM分期[2]：Ⅰ期1例，Ⅱ期10例，Ⅲ期24例，Ⅳ期27例。肺部良性疾病患者系本院呼吸内科同期住院治疗的30例患者，男18例，女12例；年龄45～74岁，平均（58.1±6.9）岁；其中肺部感染8例，慢性阻塞性肺疾病15例，气胸7例。16例健康志愿者为本院查体中心体检者。男10例，女6例；年龄46～68岁，平均（57.3±6.8）岁。3组性别（x2=0.18，P>0.05）、年龄（方差分析，F=1.05，P>0.05）差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 所有患者均于确诊后放化疗前凌晨空腹采集外周静脉血5 mL，健康志愿者血液标本由本院查体中心提供。标本4℃静置2 h，3000 r/min离心10 min，留取血清，将血清标本置-80℃保存。

1.2.2 血清DNA提取 采用QIAamp Blood Mini Kit DNA抽提试剂盒（QIAGEN公司，德国）提取血清DNA。每份标本使用2 mL血清，按照说明成比例地增大所需的反应试剂用量，多次过离心柱，最后以50 μL灭菌去离子水洗脱DNA，-80℃保存。

1.2.3 亚硫酸氢钠修饰 参照Zinn RL等[3]的方法，对所提取的血清DNA进行亚硫酸氢钠修饰，将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U）。

1.3 PCR扩增

1.3.1 MGMT的PCR扩增

1.3.1.1 MGMT的CpG岛信息 MGMT基因的CpG岛位于染色体（chr10：131154939-131155700），共762个bp，（C+G）%为56.8%。具体序列如下：

CGCGCTCCGGGCTCAGCGTAGCCGCCCCGAGCAGGACCGGGATTCTCACTAAGCGGGCGCCGTCCTACGACCCCCGCGCGCTTTCAGGACCACTCGGGCACGTGGCAGGTCGCTTGCACGCCCGCGGACTATCCCTGTGACAGGAAAAGGTACGGGCCATTTGGCAAACTAAGGCACAGAGCCTCAGGCGGAAGCTGGGAAGGCGCCGCCCGGCTTGTACCGGCCGAAGGGCCATCCGGGTCAGGCGCACAGGGCAGCGGCGCTGCCGGAGGACCAGGGCCGGCGTGCCGGCGTCCAGCGAGGATGCGCAGACTGCCTCAGGCCCGGCGCCGCCGCACAGGGCATGCGCCGACCCGGTCGGGCGGGAACACCCCGCCCCTCCCGGGCTCCGCCCCAGCTCCGCCCCCGCGCGCCCCGGCCCCGCCCCCGCGCGCTCTCTTGCTTTTCTCAGGTCCTCGGCTCCGCCCCGCTCTAGACCCCGCCCCACGCCGCCATCCCCGTGCCCCTCGGCCCCGCCCCCGCGCCCCGGATATGCTGGGACAGCCCGCGCCCCTAGAACGCTTTGCGTCCCGACGCCCGCAGGTCCTCGCGGTGCGCACCGTTTGCGACTTGGTGAGTGTCTGGGTCGCCTCGCTCCCGGAAGAGTGCGGAGCTCTCCCTCGGGACGGTGGCAGCCTCGAGTGGTCCTGCAGGCGCCCTCACTTCGCCGTCGGGTGTGGGGCCGCCCTGACCCCCACCCATCCCGGGCGAGCTCCAGGTGCG

1.3.1.2 MGMT的引物设计及PCR反应体系 参照文献[4]设计MGMT引物，分别识别甲基化特异性（M）和非甲基化特异性序列（U）。MGMT具体序列为：M正义引物：5'-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3'，M反义引物：5'-GCACTCTTCCGAAA-ACGAAACG-3'；扩增产物大小81 bp。U正义引物：5'-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3'，U反义引物：5'-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3'；扩增产物大小93 bp。

PCR反应体系20 μL，其中去离子水14.95 μL，10×PCR缓冲液 2 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.2 μL，dNTPs （10 mmol/L）0.25 μL，上下游引物各0.2 μL （25 pmol），修饰后的DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶（10 U/μL）0.2 μL，充分混匀后置DNA扩增仪中扩增。反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性30 sec、66℃退火35 sec、72℃延伸40 sec，共35个循环，最后72℃延伸10 min。

1.3.2 RASSF2的PCR扩增

1.3.2.1 RASSF2的CpG岛信息 RASSF2基因的CpG岛位于染色体（chr20：47537-4752146），共1133个bp，（C+G）%为64.4%。具体序列如下：

CGAAAAACACGTTCTAGGCGCCGGGATTCCAGATACCTGGGAAATAGAGTGCACGCAGCTGTTGAGAGGCCTCGCGCTTGGCTTCTCCTATCACTGAGGCGCAGAGGTGCTGTGGACAGCCCAGACCCACACGGCGCCCGAGGTGAAACAGAACCCTCAGTCTCCCTATGAGGCCACTGGCACTCTCGGCTGTCCCCAGAGCTCTCCGACTTAGAGCTGAATGCAAAGTAAGCGCTCGAAATGCAGAAGTAGCCGGGGCCGCCCACGGCACCTGCCTCGCTCGGGGCGAGAGAAGACGCCAGGCTGAGGTCCCAGCGACCTCAGGCACCAGCTCCGAAGGAGGGCGGGGAGACCGCAAAGGGGAAGTGCCCGGAGGGCCAACGGCCCCCGCGCACCCTGCGCCCCTCTGAAGCGCGCCGCCTCCCCGCGCCGGGGACTGGGACCTGCCTCTGGGGAATCCGCCTAGAAGACGGCGGCGGACTGGGGTCGGGCACTCTCCAGGGCTGTCAGGCCCTCCCCAGCCCTGCACCTGCCGCGCCGCCCCACCTCGCCAGGAAGTCTCAGAGACCCCGGGGATGGGGTGGGAGCGCCTTCCCATCGCGGGCTCAAAAAGAAGGAAGGACGCCCCCAGGGGTCGTAGAAGGAGGACTAGCTCCAAGCCACAACTTTCTTCGGACCCAAGGCAGGCCGGCTGGGGCTCCGCGCCTACACGGCCCCTGGCGGGGGTCCGCGCGCCCCGGGAGCCCCGCGGCTCGGGGAGGAAAGAGGAGACAAGAGACAGGCGAGGATTACGGGGCTGACCCAGCCGGGGTAGGGACCATCGTGGAAAAACTTTGGCGAGGTGGGGGGACGCGGAAAGAGAGCGGCCCGCGCCCTGCACCTTGCGCCGGGCATCCCGCGCCAGTGCCTCGCTCCCAGTGCCCCGCGCCCCGCGCCCCGCGCCTTGCCTTCACCCCGGGCCAGCTGCATCGCGCCCGCGCCGCAGGAACCGTGGAGTTGGAAAGTGGGGGCGCCGCGGCTGGGGGGCTGCTTCAGCTGCGCCTCGGCCAGCGATCGGCGGGCCGGGCTCAAATCCAGCCAGGCTGGGCAGGCGGTGGCCGCGCGACTGGGGACCGGGCGCCCCGCCCTCCTCG

1.3.2.2 RASSF2的引物设计及PCR反应体系 参照文献[5]设计RASSF2引物，分别识别甲基化特异性（M）和非甲基化特异性序列（U）。RASSF2引物具体序列为：M正义引物：5'-CGAAGGAGGGCGGGGAGATC-3'，M反义引物：5'-TCCGCCGCCGTCTTCTAAACG-3'；扩增产物大小148 bp。U正义引物：5'-GTTTTGAAGGAGGGTGGGGAGATT-3'，U反义引物：5'-AATCCACCACCATCTTCTAAACA-3'；扩增产物大小154 bp。

PCR反应体系20 μL，其中去离子水14.95 μL，10×PCR缓冲液 2 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.2 μL，dNTPs （10 mmol/L）

0.25 μL，上下游引物各0.2 μL（25 pmol），修饰后的DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶（10 U/μL）0.2 μL，充分混匀后置DNA扩增仪中扩增。反应条件为：95℃预变性15 min，55℃变性15 sec，72℃延伸30 sec，共5个循环，最后72℃延伸7 min[5]。

1.4 RUNX3的PCR扩增

1.4.1 RUNX3的CpG岛信息 RUNX3基因的CpG岛位于染色体（chrl：21354-252419），共636个bp，（C+G）%为69.0%。具体序列如下：

CGAGACCACCCTGGAGCGCAGGTCCCATTCCCGCCCGGAGCCTCGGAGCCGGCCCATCACTGGTCTTGAAGGTTGTTAGGGTCCCCGCCTCCAGCGGGAGGAGTCCACCAGGGCGGTCAGTAGGGCCGCCACACGGCCTCATCCATGCGGCCTGGCGTGCTCAGGGCCGTGGGTGAGTTGCTGTGGCTGCCGTCGGCCTCCACGCCATCACTCTGGCCGCCCAGGCTGGGGTTCATGAGGTTGCCGGCGGCGACAGAGGCAGCGCTGCTGGTGCAAGAGGCCAGCATGCGGGTAGGTGAGCGGTCGCCCCCACTGCTGCTGCCGGCCACCATGGAGAACTGGTAGGAGCCAGAGGATGTCCCGTAGTAGAGGTGGTAGGGGGACGGGTTGGCCTGGAAGGGCCCGCTCTGGTTCTGCGGGGCCCCCGGGTAGGGTGGCGGGAGGTAGGTATGGTGGAAGCGGCTGGTGGCCGGCATGCCCGCCACGCTGAGGCTGCTGATGCTCGTGCCCGAGGGCGTGGCGCTGTAGGGGAAGGCAGCTGACATGGCCCCGGGATAATGCATCCTGGGGTCTGGGAAGCGGCTCTCCGTGAGGGTTGGCAGCGTGGGGAAGGAGCGGTCAAACTGGCGGGGGTCG

1.4.2 RUNX3的引物设计及PCR反应体系 参照文献[6]设计RUNX3引物，分别识别甲基化特异性（M）和非甲基化特异性序列（U）。RUNX3引物具体序列为：M正义引物：5'-GCGGTAAGATGGGCGAGAATA-3'，M反义引物：5'-CACGAACTCGCCTACGTAATC-3'；扩增产物大小234 bp。U正义引物：5'- TGGTAAGATGGGTGAGAATA3'，U反义引物：5'-CACAAACTCACCTACATAATCC-3'；扩增产物大小234 bp。

PCR反应体系20 μL，其中去离子水14.95 μL，10×PCR缓冲液 2 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.2 μL，dNTPs （10 mmol/L）0.25 μL，上下游引物各0.2 μL（25 pmol），修饰后的DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶（10 U/μL）0.2 μL，充分混匀后置DNA扩增仪中扩增。反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性30 sec，M引物60℃退火40 sec，U引物56℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，共55个循环，最后72℃延伸5 min[7]。

1.5 统计学方法

统计学分析在SPSS13.0版软件包上完成，定量资料采用t检验，分类资料采用x2检验或Fisher精确概率法检验，多个率的比较用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MGMT基因启动子区甲基化率

62例NSCLC患者中，有17例血清DNA MGMT基因甲基启动子区域CpG岛发生了异常的过度甲基化（图1），检出率为27.42%，而良性肺部疾病患者和健康体检者血清未检出MGMT基因甲基化，经统计学分析，差异有统计学意义（Fisher精确概率法，P<0.05）。

2.2 MGMT基因启动子区甲基化状态与临床病理的相关性

NSCLC患者血清MGMT基因甲基化状态与年龄、性别、病理类型和分化状况无明显相关（P>0.05）。甲基化组吸烟指数（620.78±135.34）高于非甲基化组（498.96±150.87）（t=2.91，P<0.05）。MGMT基因甲基化多见于晚期患者，Ⅰ～Ⅱ期甲基化率为0（0/11）而Ⅲ～Ⅳ期为33.33%（17/51）（Fisher精确概率法，P<0.05）。

2.3 RASSF2基因启动子区甲基化率

62例NSCLC患者中，有24例血清DNA RASSF2基因甲基启动子区域CpG岛发生了异常的过度甲基化（图2），检出率为38.71%，而良性肺部疾病患者和健康体检者血清未检出RASSF2基因甲基化，经统计学分析，差异有统计学意义（x2=22.89，P<0.01）。

2.4 RASSF2基因启动子区甲基化状态与临床病理的相关性

NSCLC患者血清RASSF2基因甲基化状态与年龄、性别、临床分期、病理类型和分化状况无明显相关（P>0.05），与吸烟状况有关，吸烟者甲基化率（26.83%，11/41）低于不吸烟者（61.90%，13/21）（x2=7.20，P<0.05）。

2.5 RUNX3基因启动子区甲基化率

62例NSCLC患者中，有25例血清DNA RUNX3基因甲基启动子区域CpG岛发生了异常的过度甲基化（图3），检出率为40.32%，而良性肺部疾病患者和健康体检者血清未检出MGMT基因甲基化，经统计学分析，差异有统计学意义（Fisher精确概率法，P<0.05）。

3 讨论

本研究用基因测序法检测了62例肺癌患者（肺癌组）、30例肺部良性疾病患者和16例健康志愿者（对照组）外周血血清中MGMT基因启动子的异常甲基化状态，肺癌组MGMT基因甲基化频率为27.42%（17/62），而对照组为0（0/46），两组甲基化率差异有统计学意义。MGMT基因甲基化状态与年龄、性别、病理类型和分化状况无明显相关。甲基化组吸烟指数高于非甲基化组。MGMT基因甲基化多见于晚期患者，Ⅰ～Ⅱ期甲基化率为0（0/11）而Ⅲ～Ⅳ期为33.33%（17/51），与Dammann等[8]研究报道的结果相近。Liu等[9]研究发现，MGMT等基因DNA甲基化状态和TNM分期是独立的预后因子。

本研究用基因测序法检测62例肺癌患者（肺癌组）和30例肺部良性疾病患者和16例健康体检者（对照组）血清中RASSF2启动子区域甲基化状况，研究发现：肺癌组RASSF2基因甲基化频率为38.71%（24/62），而对照组为0（0/46），两组甲基化率差异有统计学意义。RASSF2基因甲基化状态与年龄、性别、临床分期、病理类型和分化状况无明显相关，与吸烟状况有关，吸烟者甲基化率低于不吸烟者。Rong等[10]研究了RASSF2启动子CpG岛甲基化状态，发现肺癌细胞株中RASSF2基因甲基化率为44%（22/50），其数据表明，在大肠癌、乳腺癌和肺癌中，RASSF2经常发生甲基化，与本研究结论相似。

本研究用基因测序法检测62例肺癌患者（肺癌组）和30例肺部良性疾病患者和16例健康体检者（对照组）血清中RUNX3、启动子区域甲基化状况，研究发现：肺癌组RUNX3基因甲基化频率为40.32%（25/62），而对照组为0（0/46），两组甲基化率差异有统计学意义。RUNX3基因甲基化状态与年龄、性别、吸烟状况、临床分期和分化状况无关，与病理类型有关，腺癌甲基化率高于鳞癌。研究表明，肿瘤患者外周血中存在一定数量的DNA，并且含量远高于正常人，可能来源于肿瘤细胞坏死释放。血清易于取得，因此是理想的DNA甲基化检测标本。本研究用基因测序法检测了62例NSCLC患者、30例肺部良性疾病患者和16例健康志愿者外周血血清中RASSF1A基因启动子的异常甲基化状态，RASSF1A基因甲基化检出率为45.16%，与Hesson等[11]报道的结果相近，略高于Rong等[10]报道的结果。而且，RASSF1A启动子甲基化仅在NSCLC患者肿瘤细胞中存在，提示其具有良好的肿瘤特异性[12-15]。

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（收稿日期：2013-03-03）