猴头菇菌丝体和发酵液中多糖的含量测定

刘晓明?闫云宇?毕华?高振强

1.河北省食品药品检验院，河北石家庄 050011；2.河北医科大学第三医院，河北石家庄 050051

[摘要] 目的 分别测定猴头菇菌丝体、猴头菇发酵液提取的粗多糖中的多糖含量。 方法 采用蒽酮-硫酸比色法，利用紫外分光光度计测定多糖含量，样品与对照品分别在450～750 nm波长范围内扫描。 结果 最大吸收波长为（625±1）nm，猴头菇多糖检测浓度在20～100?g/mL（r2=0.999）范围内与吸光度线性关系良好；加样回收率为96.0%。 结论 猴头菇菌丝体与发酵液提取的粗多糖中多糖含量均能达到30%以上。

[关键词] 猴头菇菌丝体；猴头菇发酵液；多糖；含量测定

[中图分类号] S646 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）06-94-02

猴头菌（Hericium erinaceus，Bull.Ex Fr.）又名猬菌、刺猬菌、小刺猴头、猴菇、猴头菇，隶属于担子菌门，齿菌科[1]，是著名的药食两用菌。猴头菇味甘，性平，归脾、胃经。猴头菇多糖是猴头菌的主要活性成分之一，具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗突变、防辐射等作用[2]。猴头菇多糖制成的药物和保健品深受人们喜爱，开发前景广阔。目前，通过猴头菇子实体提取猴头菇多糖的方法研究较多，但猴头菇子实体的生长周期相对较长，本文研究的是发酵的方法获得的多糖，具有生长周期短，提取多糖速度快的特点。因此，液体深层发酵是开发猴头菇活性成分的有效手段。但是在发酵获得多糖的方法中，采用菌丝体提取多糖的研究较多，而积极利用发酵液提取多糖的方法较少报道，本实验通过对猴头菇菌丝体和发酵液提取的多糖含量进行比较，把发酵液也积极的利用起来，为猴头菇多糖更好的开发利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫外可见分光光度仪GBC Cintra10（澳大利亚GBC公司），高效液相（美国Waters公司），旋涡混合振荡器（江苏海门其林医用仪器厂），恒温水浴锅（北京靖卫科学仪器厂）。D-无水葡萄糖（中国药品生物制品检定所），蒽酮（北京金

龙化学试剂有限公司），浓硫酸、95%乙醇、氯仿均为分析纯，猴头菇菌种为本实验室保存。

1.2 多糖的提取与精制

1.2.1 猴头菇菌丝体的多糖提取[3] 取猴头菇成熟的菌丝体粉末（20100505、20100506、20100507、20100508、20100509批）各5 g，加入20倍的水在80℃水浴中提取3 h，5000 r/min离心10 min[2]，取上清液。60℃下减压浓缩至30 mL，过滤，滤液离心，取上清液，加入5倍体积的无水乙醇，静置过夜。抽滤，沉淀经无水乙醇、丙酮洗涤，置干燥箱中60℃干燥，得粗多糖。

1.2.2 猴头菇菌丝体发酵液的多糖提取[4] 取猴头菇成熟的菌丝体发酵液（20100505、20100506、20100507、20100508、20100509批），过滤，滤液离心，取上清液1000 mL。60℃下减压浓缩至300 mL，过滤，滤液离心，取上清液，加入5倍体积的无水乙醇，静置过夜。抽滤，沉淀经无水乙醇、丙酮洗涤，置干燥箱中60℃干燥，得粗多糖。

1.3 含量测定方法的建立

1.3.1 葡萄糖对照品溶液的配制[5] 精密称取105℃干燥至恒重葡萄糖标准品25 mg用蒸馏水定容于50 mL容量瓶中，制成浓度为0.5 mg/mL的对照品溶液，备用。

1.3.2 供试品溶液的制备 猴头菇多糖适量配制成浓度约为30 ?g/mL的溶液。样品溶液取1 mL加入4 mL 0.1%蒽酮-硫酸溶液，摇匀，置沸水中煮沸10 min，取出迅速放冷，在黑暗中放置10 min。显色后样品采用用紫外分光光度法在波长625 nm下测定含量。

1.3.3 蒽酮-硫酸溶液的配制[6] 取98%硫酸和蒸馏水适量，配制成72%硫酸液，精密称取蒽酮适量，用72%的硫酸溶液配制成含蒽酮0.1%的蒽酮-硫酸溶液。

1.3.4 吸收波长选择 取对照品适量配制成浓度为30 ?g/mL的溶液。再取样品猴头菇多糖适量配制成浓度约为30 ?g/mL的溶液。对照品、样品溶液各取1 mL分别加入0.1%蒽酮-硫酸液4 mL，摇匀，置沸水中煮沸10 min，取出迅速放冷，在黑暗中放置10 min。显色后将葡萄糖对照品、猴头菇多糖样品在紫外分光光度仪中分别在450～750 nm波长范围内扫描，结果猴头菇多糖样品和葡萄糖对照品最大吸收波长分别在625.2 nm和625.8 nm，故选定（625±1）nm为测定波长。

1.3.5 标准曲线的制备[7] 精密称取葡萄糖对照品配成0.5 mg/mL的溶液，从中分别吸取0 mL（空白），0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置于10 mL容量瓶中用蒸馏水定溶至刻度，配制成浓度为0、20、40、60、80、100 ?g/mL的溶液，作3组与此同样的平行样品。

2 结果

2.1 标准曲线

精密吸取每组中各个浓度对照品溶液1 mL分别置于试管中，照1.3.2项下显色方法显色，在625 nm波长处测定吸光度值，计算得回归方程：Y=0.007X-0.0133，r2=0.999。结果表明，葡萄糖液在20～100 ?g/mL与吸光度值呈良好的线性关系。根据测定结果计算标准曲线方程。本方法适用于测定浓度在20～100 ?g/mL的猴头菇多糖。

2.2 精密度试验

精密称取0.1572 g样品，定容于100 mL容量瓶中，待溶解完全后，精密量取1 mL定溶于10 mL容量瓶中，再取1 mL于试管中，共配制5份同样的稀释液，按标准曲线项下操作。结果RSD为0.13%（n=5），表明精密度良好。

2.3 稳定性实验

取同一份供试品（A）和对照品（B）溶液，按标准曲线项下操作，进行紫外测定。每隔15 min测定一次紫外吸收值，样品的RSD值为0.74%（n=8），对照品的RSD值为0.50%（n=8）。由实验结果可知，此方法在2 h内稳定可行，超过2 h后样品和对照品均有较大变化，因此本实验在进行含量测定时，应该在2 h内完成。

2.4 回收率实验

取猴头菇多糖的干燥粉末，精密加入葡萄糖对照品适量，照2.4项下方法操作，计算回收率。结果平均回收率为96.0%，RSD为1.12（n=6）。见表1。

2.5 猴头菇多糖样品溶液的含量测定

精密称取20100505、20100506、20100507、20100508、20100509批猴头菇菌丝体提取的粗多糖和猴头菇菌丝体发酵液提取的粗多糖约0.16 g用蒸馏水定溶于100 mL，精密量取1 mL该溶液分别稀释至10 mL，将稀释液分别按2.4项下操作测定吸光度。含量测定得样品中多糖含量见表2。

3 结论

目前对猴头菇菌丝体提取多糖的报道较多，而对其发酵液的多糖提取及利用较少。实验中本研究采用蒽酮-硫酸比色法分别对猴头菇菌丝体和发酵液提取的粗多糖进行含量测定。结果表明两者提取的粗多糖含量相差较小，均在30%以上，因此通过发酵生产猴头菇多糖时，菌丝体和发酵液均可获得可利用的多糖。积极利用起发酵液提取粗多糖，可以有效的提高猴头菇粗多糖的产量，从而更好的开发其产品。

[参考文献]

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999： 522-524.

[2] 胡斌杰，师兆忠.超声法提取猴头菇多糖最佳工艺优化研究[J].化学世界，2009，9：557-560.

[3] 吴志明，李公斌，新秀兰，等.猴头菇多糖的提取工艺[J].食品研究与开发，2011，32（7）：36-38.

[4] 张树海.猴头菇多糖提取及纯化的研究[J].食品研究与开发，2006， 27（11）：103-106.

[5] 陈勇，朱炳辉，陆惠文.猴头菇口服液中多糖的分离和测定[J].中国药品标准，2002，3（4）：21-23.

[6] 李绍平，黄赵刚，张平，等.蒽酮-硫酸法测定亮菌糖浆中多糖的含量[J].中草药，2002，33（3）：233-235.

[7] 白云娥，李青山，王毅，等.冬虫夏草多糖的含量测定[J].山西医科大学学报，2000， 31 （2）：129-130.

（收稿日期：2013-02-18）