大孔吸附树脂纯化银杏黄酮的工艺研究

程再功　顾雪梅　胡进维　李银

【摘 要】目的：研究大孔吸附树脂纯化银杏总黄酮的工艺条件及参数。方法：采用静态吸附、解吸，从6种大孔树脂中筛选用于银杏总黄酮分离的最佳树脂，并通过动态行为系统考察最佳大孔树脂的吸附性能和最优洗脱参数。结果：HPD-450型大孔树脂为分离银杏黄酮的最佳树脂，其分离的最佳工艺为，上样量为6.5倍柱体积药液，以5mL/min的流速，pH值为4.0上柱，用400mL85%乙醇以4mL/min流速进行洗脱，结论：按照最佳工艺可获得总黄酮纯度达26%以上的银杏叶提取物。

【关键词】银杏叶提取物；大孔吸附树脂；黄酮；正交试验

银杏树是中国古老的树种之一，占世界总量的70%，其叶片是一种具有很高药用价值的植物，含有黄酮、萜类内酯等多种有效成分，对于心脑血管、肿瘤、衰老等疾病的治疗和预防具有重要意义，并具有广阔的市场前景[1]。

银杏叶中含量最高的是黄酮类物质。银杏叶黄酮的主要提取分离方法有：溶剂法、树脂法、超临界萃取法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、酶法、细胞和组织培养法等[2-4]。其中树脂法为目前广泛使用的方法，本文旨在研究不同型号大孔树脂对银杏黄酮的吸附行为，确定最佳吸附树脂并优化其工艺参数，以指导大生产，提供重要参考数据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent1200型高效液相色谱仪、梅特勒XS205电子天平、梅特勒S20KPH计、IKA公司RV-10旋转蒸发仪；甲醇（色谱级）、盐酸、氢氧化钠、亚硝酸钠均为分析纯；槲皮素对照品（批号：100081-200907）、山柰素对照品（110861-201209）、异鼠李素对照品（批号：110860-201109）均购自中检所；银杏叶（商丘嘉信医药商贸有限公司）。

1.2 大孔树脂的预处理

称取树脂适量，以95%乙醇浸泡24h，使其充分溶胀。采用湿法装柱，以95 %乙醇冲洗至流出液与水混合（1∶5）不再产生白色浑浊时，用蒸馏水洗至无醇味，然后用1mol/L HCl以4BV/h的流速冲洗0.5h，即2BV，浸泡4h后，用蒸馏水洗至中性，再用1mol/LNaOH以4BV/h的流速冲洗0.5h，浸泡4h后，用蒸馏水洗至中性，备用。

1.3银杏叶浸出液的制备

取银杏叶药材，切制（2-4cm）处理，精密称取100g，加1000mL60%乙醇于65℃水浴锅中提取2h，过滤，减压浓缩至约100 mL，加入800mL水，并不断搅拌混匀，静置12h，取上清液备用。

1.4 银杏黄酮含量测定

1.4.1色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50）为流动相；检测波长360nm，流速1.0mLl/min，柱温35℃。理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于2500。

1.4.2线性关系考察

分别精密称取槲皮素对照品30mg，山奈素对照品30mg，异鼠李素对照品20mg置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，摇匀。再从中精密量取2mL、4mL、8mL、10mL、15mL分别置于100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别吸取上述对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，计算峰面积。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，线性回归得标准曲线方程。其线性范围和相关系数为：槲皮素：5.92-44.43μg/mL，r=0.9999；山奈素：5.98-44.91μg/mL，r=0.9999；异鼠李素：4.00-30.06μg/mL，r=0.9999。总黄酮苷的计算方法按《中国药典》（2010年版）一部[5]的方法计算，即将3种苷元之和乘以系数2.51。

2 结果与讨论

2.1 静态吸附试验（大孔树脂筛选）

准确称取已处理好的大孔树脂2.00g，置于具塞的磨口锥形瓶中，加入银杏叶水沉上清液（0.993mg/mL）100mL，室温振荡24h，测定吸附前后黄酮浓度的变化，按下式计算树脂的静态吸附量和吸附率。将吸附饱和的大孔树脂用水洗至洗脱液无色，滤纸吸干树脂表面残留的溶液，加入150mL85%乙醇，振荡24h，过滤，测定洗脱液中总黄酮浓度，按下式计算树脂解吸率。

吸附率=（C0×V0-C1×V1）/C0×V0×100%

树脂吸附量=（C0×V0-C1×V1）/M

解吸率=C2×V2/（C0×V0-C1×V1）×100%。

式中：C0为吸附前溶液中黄酮初始浓度，mg/mL；C1为吸附后溶液中黄酮剩余浓度，mg/mL；C2为解吸液中黄酮浓度，mg/mL；V0为吸附时黄酮粗提液加入体积，mL；V1为吸附残液体积，mL；V2为解吸液体积，mL；M为树脂用量，g。

从表1可知：HPD-417、ADS-17吸附量不高，HPD-750、DM130吸附率较大，但解吸率相对较低，而D140与HPD-450相比，具有接近的吸附量和吸附率，但解吸率不如HPD-450。综合考虑分析，HPD-450为最佳树脂，因此选择它作为后续试验的树脂材料。

2.2 动态行为考察

大孔树脂对银杏叶提取液中黄酮类成分的分离纯化受很多因素的影响，如上样液的酸碱度、上样量、吸附速度、洗脱速度、洗脱溶液的浓度和用量等，必须进行合理的考察，以确定能使银杏叶中黄酮类成分得到最佳的分离条件。

2.2.1 上样量的确定

取银杏叶水沉上清液（总黄酮浓度为0.993mg/mL，pH=4），以5mL/min的流速上树脂柱（柱体积150mL）。分别在0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8h时，测流出液的黄酮浓度，以时间为横坐标，未吸附率（未吸附率=流出液中成分含量/上柱前样品溶液成分含量×100%）为纵坐标绘制银杏总黄酮泄漏曲线，见下图：

由图1可知：在4h处，即上样量在7倍柱体积时开始明顯泄露，说明树脂吸附达到饱和。为了使总黄酮保留完全，设定吸附率10%为泄露点，即上样量最终确定为6.5倍柱体积。

2.2.2 吸附上样液PH值的确定

由图2可知pH值4.0（原液pH值时）树脂对黄酮的吸附率最高，这是由于酸性化合物在酸性条件下的吸附作用较强，碱性化合物在碱性条件下吸附作用较强。黄酮类化合物由于多含有酚羟基而显酸性，因而要达到较好的吸附效果，必须在弱酸或酸性条件下吸附，本试验中黄酮上柱液原液pH值即为4.0，故上柱前不需要调整。

2.2.3 HPD-450吸附洗脱影响因素考察

实验选择影响树脂吸附洗脱的重要因素——吸附流速、洗脱流速、乙醇浓度和乙醇使用量4个因素，分别在每个因素下选取3个水平进行正交实验，并制得因素水平表、工艺参数优选正交试验表和方差分析表。

分析：根据吸附工序工艺优选正交试验表结果直观分析，R值C>D>A>B，因素主次关系为乙醇浓度>乙醇用量>吸附流速>洗脱流速，方差分析表结果表明，因素C具有显著影响（P<0.05）。得出最佳工艺参数为A2B1C3D3，即吸附速度：5mL/min、洗脱速度：4mL/min、乙醇浓度85%、乙醇用量600mL。

2.2.4 应用

根据以上确定的吸附工序工艺参数，对应大生产所用的树脂量进行换算，得到大生产工艺参数（柱体积为300L），即上样量：1950L药液（黄酮浓度为0.993mg/mL），吸附速度：600L/h、洗脱速度：480L/h、乙醇浓度85%，乙醇用量800L，我们进行了6批放大生产，结果如下：

从表5可以看出，工艺参数经过优化后，银杏黄酮的含量有了显著的提高，平均含量已经在26%以上（原工艺平均含量为24.7%），说明优化后的工艺参数较合理，符合大生产的要求。

3 讨论

所选的6种大孔树脂中，HPD-450大孔树脂为吸附银杏黄酮的理想树脂，吸附量大，饱和吸附量达到28.3mg/g，易洗脱，解析率达91%，分离效果好，且纯度高，但吸附速度如果过快，泄露较早。

《中国药典》（2010年版）一部中规定银杏叶提取物中黄酮醇苷的含量不低于24.0%，本文通过试验室小试，优选出理想的大孔树脂并改进工艺参数，并通过车间放大生产，验证了其工艺参数的合理性。将银杏黄酮的含量由原先的24.7%提高到26%，为今后生产出高品质银杏叶提取物奠定了基础。

参考文献：

[1] 黄金龙，殷之武，何新华，等.银杏叶总黄酮纯化工艺研究[J]中草药.2012，43（5）：922-925.

[2] 林建原，季丽红.响应面优化银杏叶中黄酮的提取工艺[J].中国食品学报.2013，13（2）：83-84.

[3] 豁银强，尹杰，陈雪，等. 银杏叶黄酮的超声波提取及其抗菌研究[J].食品工业.2012，33（5）：47-49.

[4] 倪林，叶明，杨必伟. 微波-高压提取银杏叶黄酮工艺条件优化[J].食品与生物技术学报.2012，31（2）：199-205.

[5] 中国药典[S].一部.2010.