产β-环糊精葡萄糖基转移酶高温菌株HY15发酵条件优化

曹冬梅，胡耀辉

（1.吉林农业大学 食品科学与工程学院，吉林 长春 130118；2.黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319）

β-环糊精葡萄糖基转移酶（β-cyclodextrin glycosyltransferase，β-CGTase）是一种多功能型酶[1]，能通过环化、偶合、歧化、水解等反应作用于淀粉使葡萄糖基发生转移生成环糊精[2]。其中环化反应生成的β-环糊精（β-cyclodextrin，β-CD）对许多物质具有包络作用，增加了被包络客体分子的水溶性、稳定性、乳化性、释放性及其他物理性质。这使得环糊精及其各种衍生物可广泛应用于农业、食品、医药、造纸、纺织、石油、化工、环保、超分子化学、光敏材料、纳米材料以及其他功能材料十几个行业，有力的带动了这些行业的发展[3]。

工业化生产环糊精的技术是日本率先在20世纪70年代实现的，随后美国、德国、荷兰、匈牙利及中国相继发展了该项技术。目前日本和欧美的环糊精产量相当，据调查统计，近几年环糊精国际市场产量呈25%的趋势增长，至2011年其世界生产量已达40万t，并且随着环糊精广泛应用，环糊精市场将会保持超高速增长[4]。但目前β-环糊精的工业化生产中，淀粉转化率低，为50%～60%，很难有进一步突破[5]。为了提高β-CD的产量，首先需提高β-CGTase的产量。

本研究对前期实验室自长白山温泉选育出来的一株产β-CGTase的高温菌株HY15产酶时的发酵培养基及发酵条件进行优化，为后续研究其基因改造、酶的纯化和酶的性质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株：长白山温泉采集分离保存的高温菌株HY15。

种子培养基为LB 培养基[6]：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，120℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

发酵基础培养基：可溶性淀粉10g，酵母膏5g，蛋白胨10g，Na2CO30.5g，K2HPO4·3H2O 0.13g，pH7.0，120℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

1.2 仪器与设备

InfiniteM200酶标仪：TECAN公司；UV-1700PharmaSpec紫外可见分光光度计：日本岛津；TGL-16G台式离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；DL-CJ-IND超净工作台：北京市东联哈尔仪器制造有限公司；DSH2-300恒温培养振荡箱：江苏太仓市实验设备厂；CL-32L高压蒸汽灭菌器：日本ALP公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵方法

取种子培养基1.5mL接种至装有50mL发酵培养基的三角瓶中，于60℃、200r/min振荡培养48h。

1.3.2 生物量测定

取1mL发酵菌液用蒸馏水定容至10mL，测定吸光度值（OD600nm）。

1.3.3 酶活力测定[13]

取粗酶液（发酵菌液10000r/min离心3min，上清液即为粗酶液）10μL，用蒸馏水定容至100μL，取稀释液10μL（对照不加样品）加入0.2mol/L的甘氨酸-NaOH-NaCl缓冲液（pH8.55）0.2mL，置于40℃水浴锅中，加0.2%马铃薯淀粉溶液200μL（空白样不加）后计时10min马上放入冰水浴中，加入浓度为0.5mo1/L的醋酸0.5mL终止反应，再加入0.005%碘液3mL显色，以蒸馏水为空白，不加酶液为对照，测定吸光度值（OD600nm），以吸光度值下降10%的酶量定为1个酶活单位。酶活力计算公式：

式中：a 为对照组的吸光度值，b 为样品的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基的优化

2.1.1 不同碳源对菌株产酶活力的影响

在基础培养基中分别添加1%糊精、1%玉米淀粉、1%糖蜜、1%可溶性淀粉、1%麦芽糖、1%乳糖、1%果糖、1%马铃薯淀粉等碳源，按1.3.1方法发酵后，酶活力测定结果见图1。

图1 不同碳源对菌种产酶活力的影响Fig.1 Effects of different carbon sources onβ-CGTase production

由图1可知，该菌株利用最好的碳源是玉米淀粉和糖蜜，其余依次是马铃薯淀粉、可溶性淀粉、糊精、果糖、麦芽糖、乳糖。考虑到当地的玉米资源丰富，生产成本低，因此初步定为玉米淀粉+糖蜜作为复合碳源。

2.1.2 不同氮源对菌株产β-CGTase的影响

以1%玉米淀粉+1%糖蜜为碳源，在基础培养基基础上分别以1%酵母浸粉、1%玉米浆、1%蛋白胨、1%尿素、1%（NH4）2SO4、1%NH4NO4、1%NH4Cl为氮源，发酵48h后，酶活力测定结果见图2。

图2 不同氮源对菌种产酶活力的影响Fig.2 Effects of different nitrogen sources onβ-CGTase production

由图2可知，产酶量较高的是酵母浸粉和玉米浆，其次是蛋白胨和尿素，该菌株对3种无机氮源可以利用，但产酶量很低。因考虑当地资源和生产成本原因，选择玉米浆为氮源，玉米浆也是微生物生长很普遍应用的有机氮源，含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质。

2.1.3 培养基中起始MgSO4浓度对菌株产CGTase的影响

以1%玉米淀粉+1%糖蜜为碳源，1%玉米浆为氮源，在基础培养基上分别添加不同浓度的MgSO4，发酵48h后，酶活力测定结果见图3。

图3 不同浓度的MgSO4对酶活力的影响Fig.3 Effects of different concentration of MgSO4 onβ-CGTase production

由图3可知，随着MgSO4浓度增加，酶活力增加，在MgSO4浓度达到10mmol/L时菌体酶活力达到了最高。说明MgSO4对菌株酶活力有促进作用，当继续增大MgSO4浓度，菌株酶活呈下降趋势。因此MgSO4的添加量初步确定为10mmol/L。这可能与Mg2+在微生物发酵代谢过程中是许多酶的激活剂有关系[6]。

2.2 发酵工艺条件的优化

2.2.1 最适发酵温度的确定

在不同温度发酵48h后测定酶活力，结果见图4。发酵温度为60℃时，酶活力达到最高。

图4 培养温度对菌株HY15产酶活力的影响Fig.4 Effect of temperature onβ-CGTase production

2.2.2 最适pH值的确定

用NaOH或HCl调节基础培养基pH值分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，发酵48h后测定酶活，结果见图5。在初始pH值为7.0时，菌体的产酶量最高。pH值过高或过低都不利于菌体生长和产酶。

图5 初始pH值对菌株产β-CGTase的影响Fig.5 Effect of pH value onβ-CGTase production

2.2.3 最适摇床转速的确定

以110r/min、140r/min、170r/min、200r/min、230r/min作为摇床转速，发酵温度60℃，pH7.0，接种量3%，发酵48h后测定酶活，结果见图6。适宜的摇床转速为200r/min。发酵液中溶氧对细胞生长和产物生成的影响很大，摇瓶的溶氧值与摇床转速有关。

2.3 正交试验优化β-CGTase 的发酵条件

在单因素试验的基础上选择碳源、氮源、培养温度、初始pH值、MgSO4浓度、转速为试验因素，以发酵产物的酶活力为指标，采用L27（36）正交设计优化发酵条件，考虑到碳源和氮源、碳源和初始pH值、氮源和初始pH值可能存在交互作用，因此设计因素与水平见表1。正交试验结果见表2，直观分析结果见表3，方差分析结果见表4。

图6 转速对菌株产β-CGTase的影响Fig.6 Effects of rotation speed of shaker on β-CGTase production

表1 发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels oforthogonal experiments for fermentation condition optimization

表2 发酵条件优化正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiments for fermentation condition optimization

表3 正交试验结果直观分析Table 3 Intuitionistic analysis of orthogonal experiments results

表4 正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3 所得极差可知，对产β-CGTase 酶活力影响依次为氮源＞碳源＞培养温度＞初始pH值＞摇床转数＞MgSO4＞空列。由表4可知，因素A、B即碳源、氮源对酶活影响极显著，B×C、C、A×C、E、A×B对酶活影响显著，碳源和氮源、碳源和初始pH值、氮源和初始pH值的确存在交互作用，而且作用显著。由表3可看出，碳源水平1和水平2差异不显著，与水平3差异显著，氮源3个水平间差异均显著。因此选择发酵产β-CGTase的最佳试验组合是A3B2C1D2E3F2，即碳源为玉米淀粉+糖蜜，氮源为玉米浆，初始pH值为7.0，培养温度60℃、摇床转速220r/min，MgSO4浓度10mmol/L，在此条件下进行验证试验，β-CGTase 酶活力可高达1794.3U/mL。高于所有正交试验组合的结果，表明正交试验结果是可靠的。

3 结论

β-CGTase己从多种微生物中分离得到，包括浸麻芽孢杆菌（Bacllius macerna）、嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stoaorthermpohlisi）、耐碱性巨大芽孢杆菌（B.megaterium）、微球菌（Micorcoccussp.）、枯草芽孢杆菌（B.subtils）等[17-19]。但报道较多的是嗜碱芽孢杆菌，产酶水平为2000U/mL～4000U/mL[19]。本研究采用正交试验设计对菌株HY15的产酶培养基成分、发酵条件进行优化，最终确定了碳源为玉米淀粉+糖蜜，氮源为玉米浆，初始pH值7.0，培养温度60℃、摇床转速220r/min，MgSO4浓度10mmol/L，在此条件下进行验证试验，β-CGTase 酶活力可达1794.3U/mL。略低于报道的产酶水平，可能与本研究所采用当地优势产品糖蜜、玉米浆的添加量有关。但本试验所采用的菌产生的酶为嗜热酶，在酶的工业化生产可采用快捷的加热纯化法、高温酶解，防止杂菌生存，提高反应速率。为后续该菌的基因改造提供理论基础。

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