硝酸钠对发状念珠蓝细菌生长的促进作用

2013-04-23 11:52吕和鑫贾士儒肖玉朋袁南南戴玉杰
中国酿造 2013年10期
关键词:念珠氮源硝酸

吕和鑫,贾士儒*,肖玉朋,袁南南,戴玉杰

(天津科技大学 天津市工业微生物重点实验室,天津 300457)

发状念珠蓝细菌(Nostoc flagelliforme)即俗称的发菜,是一种陆生固氮蓝藻,主要分布于干燥多风、雨量稀少的地区,年降水量为167.3mm~447.4mm,平均为261.2mm,极端最低降水量47.9mm[1]。发状念珠蓝细菌在我国主要分布于西北干旱地区,如内蒙古、甘肃及青海等地。发状念珠蓝细菌在我国作为一种食品与节日礼物已有很久的历史。尤其是我国广东等南方省份,因发菜具有“发财”的谐音,受到很多人的喜爱。发菜的食用历史在我国已经有上千年,传说汉代发状念珠蓝细菌便已经作为宫廷贡品[2]。发状念珠蓝细菌在野生环境中生长非常缓慢,据观察,其年增长率仅为6%左右[3]。对发状念珠蓝细菌的过度采伐对西北干旱地区的环境造成了草地退化等严重破坏。我国政府在2000年下发通知,禁止发菜的采掘与销售等活动。因此,研究发状念珠蓝细菌的人工培养对于环境保护与满足消费市场均具有重要意义。

相比固体培养,液体培养具有生长速度快、空间占用小、培养密度高、培养条件较易控制等优势。前期研究表明,利用BG11m液体培养基培养时添加15mmol/L的碳酸氢钠可以促进发状念珠蓝细菌的生长、胞外多糖的积累、光合效率的提高[4]。硝酸钠为微生物与植物等培养中常用的氮源。本研究观察了在添加15mmol/L碳酸氢钠时不同硝酸钠浓度对发状念珠蓝细菌生长、胞外多糖含量以及光合速率的促进作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发状念珠蓝细菌分离细胞由天津科技大学天津市工业微生物重点实验室保存。采用添加15mmol/L NaHCO3的修改过的BG11m培养基为基础培养基,分别添加0、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L的硝酸钠以制成不同质量浓度梯度NaNO3的BG11m培养基。

浓硫酸(天津市文达稀贵试剂化工厂),苯酚(天津科密欧化学试剂开发中心),无水乙醇(天津市四通化工厂),无水葡萄糖(天津市永大化学试剂开发中心),氯化钠(天津北方天医化学试剂厂),盐酸、氢氧化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾(天津化学试剂三厂);所用药品均为AR级。

1.2 仪器与设备

液相氧电极:英国Hansatech公司;PHSJ-4A pH计:上海雷磁仪器厂;722型分光光度计:北京光学仪器厂;LD5-2A台式高速离心机:上海医用分析仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

利用500mL玻璃摇瓶,加入200mL有梯度浓度NaNO3的BG11m培养基静置培养,光照强度为60μmol/(m2·s),培养温度为25℃。连续培养15d后取样测定各生理指标。

1.3.2 生理指标测定方法

干重法生物量分析:100mL发酵液,4000r/min离心10min收集藻体,80℃烘至质量恒定。

叶绿素含量测定采用甲醇提取法[5]。

胞外多糖(exopoly saceharides,EPS)测定:采用苯酚-硫酸法[6]。

光合作用放氧速率测定:采用液相氧电极(Oxylab,Hansatech公司)测定溶解氧变化[7]。

藻体蛋白质含量测定:按照GB 5009.5—2010[8]《食品中蛋白质测定》的方法。将0.25g藻体、0.2g CuSO4、6gK2SO4、20mL浓硫酸混合均匀,300℃加热30min,之后400℃加热直至溶液变成透明浅蓝色为止;冷却后用0.1mol/L的HCl进行滴定。

阴离子浓度测定:磷酸根测定采用钼蓝比色法,GB11893—1989《水质总磷测定》[9];硝酸根测定采用水杨酸-浓硫酸法[10],用浓硫酸配制5%(w/v)的水杨酸试剂,分别吸取0~1.0g/L的硝酸钠溶液0.1mL于试管中,加入0.4mL水杨酸试剂,室温放置20min,然后加入9.5mL 2mol/L的NaOH溶液,冷却至室温后,于波长410nm处测定吸光度值,绘制标准曲线。用浓硫酸代替水杨酸试剂,作为空白,以消除浓硫酸和样品中物质反应而带来的影响。取适当稀释的样品,同法操作,测定硝酸根含量。

1.4 数据分布方法

采用Origin 7.0统计分析数据,采用SPSS软件的Post Hoc Test进行差异显著性分析。

2 结果

2.1 不同浓度NaNO3对发状念珠蓝细菌生物量的影响

由图1可知,在补加15mmol/L的NaCO3情况下,补加一定质量浓度的NaNO3可以促进发状念珠蓝细菌的生长。随着NaNO3质量浓度增加,对细胞生物量的积累具有明显促进作用,在添加质量浓度为2.0g/L时,细胞生物量为0.83g/L,相比没有加NaNO3的空白对照生物量提高了43%。随后NaNO3添加质量浓度的继续增加,细胞生物量不再增加,达到平衡(p>0.05)。因此,从对细胞的生长速率以及生产成本来说,添加质量浓度为2.0g/L时,最适合发状念珠蓝细菌细胞的生长;在BG11m作为培养基时,NaNO3质量浓度超过2.0g/L之后,氮源不再是生长的限制性营养因素。

2.2 不同浓度NaNO3对发状念珠蓝细菌生理活动的影响

图1 不同的NaNO3浓度对细胞生物量的影响Fig.1 Effects of different concentrations of NaNO3 on the biomass ofN.flagelliforme

表1为不同浓度NaNO3培养15d后的光合与呼吸作用、胞外多糖(EPS)、蛋白质以及硝酸根与磷酸根的消耗量的结果。通过表1可以看出,细胞呼吸作用在NaNO3质量浓度为2.5g/L时达到最大,而净光合作用在2.0g/L时较高。叶绿素随着NaNO3质量浓度的增加而增加,在3.0g/L时达到30.64mg/g;胞外多糖在NaNO3质量浓度为0时,为50.95mg/L,达到这些浓度中的最大值,表明氮源浓度的提高不利于胞外多糖的积累,此结果与于海峰[11]研究的结果是一致。细胞中蛋白质的含量随着NaNO3质量浓度的增加而增加。在3.0 g/L时,达到最大值,说明在碳源提供充足的条件下,外加充足的氮源可以促进细胞内蛋白质含量的合成。细胞消耗的营养盐随着NaNO3质量浓度的增加而增加,这与细胞生物量、细胞内外分泌物以及藻类生成其他物质相关。硝酸根的消耗随着NaNO3质量浓度的升高逐渐升高,这与细胞生物量与细胞蛋白质含量的增加相一致。磷酸盐的消耗虽然在NaNO3质量浓度为2.0g/L与2.5g/L时浓度变小,但是在NaNO3质量浓度达到3.0g/L时磷酸根消耗出现明显增加,在NaNO3质量浓度为2.0g/L与2.5g/L时磷酸根消耗出现的下降的原因可能为分析方法的精确度不够。

2.3 对发状念珠蓝细菌细胞生长pH值的影响

添加NaHCO3浓度为15mmol/L,NaNO3的质量浓度分别为1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L,在500 mL三角瓶中培养15d后,使用pH计测定培养液pH值。

由图2可知,当NaHCO3浓度一定,NaNO3的质量浓度分别为1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0g/L时,培养液的pH值之间相差不大,为8.67~8.76。由图2可知,在添加NaNO3的浓度为0g/L时,细胞培养结束时pH值达到了9.32,明显高于添加NaNO3实验组,说明NaNO3在提供氮源的同时,对发酵液的pH值有明显的缓冲作用。

表1 不同的NaNO3浓度对细胞光合、胞内外产物以及消耗物质的影响Table 1 Effects of NaNO3 on photosynthesis,production and consumption ofN.flagelliforme

图2 NaNO3浓度对发状念珠蓝细菌细胞生长pH值的影响Fig.2 Effects of different concentrations of NaNO3 on pH value ofN.flagelliforme borth

3 结论与讨论

研究结果表明,在添加15mmol/L的NaHCO3时添加无机氮源NaNO3可以促进发状念珠蓝细菌的生长。通过测定不同质量浓度NaNO3下的生物量,表明随着添加NaNO3质量浓度的增加,生物量的积累逐渐增加,在NaNO3质量浓度为2.0g/L时,对细胞生长的促进作用最大,藻细胞干质量达到最大值,相对应,净光合速率也达到最大值。随着添加浓度的继续增加,细胞干质量达到平衡。细胞呼吸作用在NaNO3含量为2.5g/L时最大。细胞蛋白质含量随NaNO3质量浓度的增大逐渐升高,细胞对NO3-与PO43-的利用率也逐渐增高。在不同NaNO3浓度下,培养15d后的培养液的pH值差异不显著,但是添加组的最终pH值明显比不加硝酸钠的空白对照要小,可见无机氮源对于培养液的pH值具有一定的稳定与缓冲作用。

发状念珠蓝细菌是一种固氮蓝细菌,可以利用光合作用捕获的光能进行固氮作用[12]。外加无机氮源可以促进微藻的生长在许多藻种中已经有许多的报道。可能的机制为两方面:第一是降低了藻细胞用于固氮的能量,将更多的光合作用捕获的光能用于其他的代谢途径中;第二是为蛋白质合成与其他需要氮元素的代谢途径提供了充足的氮源进而促进了整个细胞的生长。硝酸盐是微藻中常用的氮源,硝酸根依次在硝酸根还原酶以及亚硝酸还原酶的作用下最终还原为铵根,进一步用于氨基酸的合成等代谢途径。

研究表明,添加一定质量浓度的NaNO3可以促进发状念珠蓝细菌的生长,在硝酸根含量达到2g/L后细胞的生物量不再增加,但是光合色素叶绿素的含量进一步增加,但是总光合速率与净光合速率在2.0g/L达到最大然后降低。另一方面,呼吸速率随着NaNO3质量浓度的增加,呼吸速率逐渐增加。对这个现象一个可能的解释是随着硝酸根的提高,光合能力被逐渐抑制,但是较多氮源的存在需要更多地还原力如还原型辅酶Ⅰ(NADH)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)用于硝酸根的还原,因此更多地叶绿素a(光合中心色素)捕获的光能用于进行环式光合磷酸化,为硝酸还原酶与亚硝酸还原酶提供更多的还原力。硝酸根利用的增加与蛋白质含量的增加是一致的。EPS分泌的减少可能的原因是EPS 呈现酸性[13-15],具有降低培养液pH值的作用,加有NaNO3的培养液的pH值相比NaNO3空白对照有所降低,因此导致EPS分泌的减少。

[1]钱凯先,朱洁然.发状念珠藻的生态条件及其规律分析[J].植物生态学与地植物学报,1989,13(2):97-104.

[2]戴治稼.发菜的主要营养成分及利用价值[J].食品科学,1985(8):53-54.

[3]戴治稼.发菜研究的回顾[J].宁夏大学学报:自然科学版,1992,13(1):71-76.

[4]袁南南,贾士儒,戴玉杰,等.NaHCO3对发状念珠蓝细菌光合作用及生长的影响[J].中国酿造,2012,31(1):34-36.

[5]MILLER GL.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J].Anal Chem,1959,31(3):426-428.

[6]白雪娟,苏建宇,赵树欣,等.发菜细胞培养液中多糖含量测定方法的比较研究[J].食品工业科技,2004,25(11):146-150.

[7]于海峰,贾士儒,董永胜,等.有机碳源对发状念珠藻单体细胞生长和光合作用的影响[J].高校化工学报,2008,22(2):277-281.

[8]中华人民国和国卫生部.GB 5009.5-2010 食品中蛋白质的测定方法[S].2010.

[9]MURPHY J,RILEY JP.A modified single solution method for the determination of phosphate in natural waters[J].Anal Chim Acta,1962,27(1):31-36.

[10]CATALDO DA,MAROON M,SCHRADER LE.Rapid colorimetric determination of nitrate in plant tissue by nitration of salicylic acid[J].Commun Soil Sci Plant Anal,1975,6(1):71-80.

[11]于海峰.发状念珠蓝细菌单体细胞高密度培养的研究[D].天津:天津科技大学博士论文,2007.

[12]SCHERER S,ERNST A,CHEN TW,et al.Rewetting of drought-resistant blue-green algae:Time course of water uptake and reappearance of respiration,photosynthesis,and nitrogen fixation[J].Oecologia,1984,62(3):418-423.

[13]JIA SR,YU HF,LIN YX,et al.Characterization of extracellular polysaccharides fromNostoc flagelliformecells in liquid suspension culture[J].Biotechnol Biopr Eng,2007,12(3):271-275.

[14]YU HF,JIA SR,Dai YJ.Accumulation of exopolysaccharides in liquid suspension culture ofNostoc flagelliformecells[J].Appl Biochem Biotech,2010,160(2):552-560.

[15]DING Z,JIA SR,HAN PP.Effects of carbon sources on growth and extracellular polysaccharide production ofNostoc flagelliformeunder heterotrophic high-cell-density fed-batch cultures[J].J Appl Phycol,2013,25(4):1017-1021.

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