烟草疫霉拮抗菌筛选、鉴定及发酵条件研究

丛 铭，施渺筱，张传萍，葛永怡，陈 雪，李 祝*

（1.贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2.安顺学院，贵州 安顺 561000；3.毕节市烟草公司，贵州 毕节 551700）

烟草疫霉病Phytophthora parasiticavar nicotianae（Breda de Hean）Tuker是我国烟草生产危害严重的病害之一，除东北烟区零星发生以外，包括台湾省在内的华南、华中、华东和西北种植烟区均广泛发生，经济损失较为严重。

目前生产上一般采用抗病品种、栽培防治以及化学防治的综合防治措施，但由于该病菌的游动孢子形成速度快且数量大，侵染烟株后潜育期短、发病快，在一个生长季节可以发生多次再侵染，同时该病有时还与其他病害混合发生，从而导致一些抗黑胫病品种抗性的丧失；化学防治中化学农药的采用，短期内有效，但长期反复施用，会造成烟株药害、烟株农药残留和病菌对农药的抗药性[1]。从现有植物病害生物防治的研究报道来看，采用的微生物种类有细菌、真菌、病毒等微生物，其中细菌种类较多[2]，特别是芽孢杆菌因其具有较强的抗逆性、容易保存显示出巨大的生防潜力和前景。

生物防治是国际上目前进行植物病害防治的首选防治措施，这种从自然界中分离、筛选有益微生物并用于病原微生物的拮抗、抑制作用的防治方法，具有高效、无毒、无残留和低成本等特点[3]，所以，生物防治策略的优点和重要性就逐渐凸显出来，越来越受到烟草界人士的关注。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌

菌株来源：采自贵州省毕节8个县市种植烟草的田地土壤样品122份，贵州大学生命科学学院真菌资源研究室分离、筛选、保存。

供试指示菌：本实验采用烟草黑胫病菌病原菌烟草疫霉（Phytophthora parasitica）作为病原指示菌，贵州大学微生物实验室分离、筛选、鉴定、保存。

1.1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.2。

燕麦培养基[4]：燕麦30g，琼脂20g，pH值自然（燕麦片30g，加入1000mL蒸馏水，100℃水浴约1h，8层纱布过滤去渣，再加蒸馏水补足1000mL）。

10% V8培养基[5]：10mL V8果汁加去离子水90mL，CaCO30.02g，琼脂2g，用于培养待接种疫霉菌丝块，121℃灭菌20min。

NYBD培养基[6]：牛肉浸膏8.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖10.0g，蒸馏水1000mL。

1.2 仪器与设备

AIRTECH超净工作台：苏净集团安泰公司；BS224S电子天平：Sartorius 公司；DELTA320 pH 计：梅特勒-托利多公司；LDZX-50KBS立式压力灭菌锅：上海申安医疗机械厂；Sky2102C控温摇床：Sukun 公司；YSEI电热鼓风干燥箱：永生仪器公司；EPS 100电泳仪：Tanon 公司；DRP-9002生化培养箱：上海森信实验仪器有限公司；TDL-500B离心机：上海安亭科学仪器厂；SHZ-82A数显恒温振荡器：金坛市富华仪器有限公司；QHZ-98B振荡培养箱：太仓华美生化仪器厂；759紫外可见光分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；RH Basic磁力搅拌器：广州IKA 公司；S1000PCR仪：Eppendorf 基因有限公司。

1.3 筛选方法

1.3.1 菌株的分离

平板稀释涂布法[7]：称取10g风干的土样放于盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置于160r/min的摇床上振荡30min，静置5min，吸取1mL悬浮液置于装有9mL无菌水的试管中，混匀后逐级梯度稀释，取10-4、10-5和10-63个梯度的悬浮液0.1mL于倒好冷却的牛肉膏蛋白胨平板表面，每个梯度3个平行，涂布，于37℃培养48h。挑取菌落形态不一样的单菌落在斜面上划线保种，培养24h，置于4℃冰箱中保存备用。

1.3.2 平板对峙法筛选拮抗细菌

初筛：用直径0.5cm的打孔器将烟草疫霉菌丝块接种于燕麦培养基平板中心，在距平板中央2.5cm十字交叉处等距离接种不同的分离菌，以不接种分离菌为对照，每处理3次重复。28℃培养，对照长满全皿时，记录抑菌圈大小[8]。

复筛：将纯化的菌体筛选有抑菌效果菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，160r/min、28℃培养48h。采用发酵液滤纸片扩散法，对初筛拮抗效果明显的烟草黑胫病菌拮抗菌菌株进行复筛，每个初选菌株做3个平行，方法同初筛。28℃培养，对照长满全皿时，观察并记录。挑取抑菌圈周围的烟草疫霉菌丝制片，显微观察。

1.4 拮抗细菌的鉴定

形态特征、培养性状和生理生化特征：用平板划线法将菌种接种于平板培养基上，37℃培养24h，按常规方法观察菌落形态（大小、形状、边缘、光泽、质地、透明程度和菌落及培养基颜色等），进行革兰氏染色，芽孢染色。

参照《常见细菌系统鉴定手册》[9]、《伯杰细菌鉴定手册》（第九版）[10]和《芽孢杆菌属》[11]对菌株讲行生理生化鉴定。接触酶、糖发酵实验、V-P实验、淀粉水解实验、柠檬酸盐利用实验、耐盐性和需盐性实验、pH5.7生长实验、牛奶分解、硝酸盐还原、吲哚实验和明胶液化实验。

16S rDNA 序列分析：采用上海生工Ezup柱式基因组DNA 抽提试剂盒（细菌）提取。

PCR 反应体系（25μL）为DreamTaqTMGreen PCR Master Mix（2×）：12.5μL；上游引物：2μL；下游引物：2μL；ddH2O：6.5μL；模板DNA：2μL；总体积：25μL。

PCR反应条件为94℃、3min；94℃、45s，54℃、30s，72℃、1min，25个循环；72℃终延伸5min，4℃保存[4]。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将所得序列通过NCBI—BLAST 进行序列比对分析

1.5 拮抗菌株液体发酵条件优化

本实验对其液体发酵条件进行优化，即对菌株1205的培养时间、装液量、培养温度、起始pH值、摇床转速、接种量进行研究。以摸索最佳培养条件和相关技术要素，进一步提高其发酵滤液中活性成分的含量，为工业化生产提供基础资料。

1.5.1 培养时间对菌株生长及产生抑菌物质的影响

取1mL振荡培养12h的细菌液（1×108CFU/mL）接种于30mL NYBD培养液中，28℃、160r/min培养，分别在4h、8h、12h、16h、20h、24h、30h、36h、40h、48h、60h等时间取样，每处理重复3次，以不接菌培养液为对照，用分光光度计测定波长600nm处的吸光度值。

1.5.2 装液量对菌株生长的影响

在100mL三角瓶中分别装入10mL、20mL、30mL、40mL、50mL NYBD培养液，灭菌后按3%接种量接入菌龄为12h的种子液（1×108CFU/mL），置32℃、160r/min培养24h，每处理重复3次，以不接菌培养液为对照，用分光光度计测定波长600nm处的吸光度值，计算不同装液量处理下培养液的细菌含量。

1.5.3 温度对菌株生长的影响

接种1mL振荡培养12h的细菌液（1×108CFU/mL）于30mL NYBD培养液中，分别于20℃、24℃、28℃、30℃、32℃、36℃、38℃、40℃条件下160r/min培养24h，每处理重复3次，取培养液以不接菌培养液为对照，用分光光度计测定波长600nm处的吸光度值，计算不同温度培养的细菌含量。

1.5.4 接种量对菌株生长的影响

取振荡培养12h的细菌液（1×108CFU/mL）分别按1%、3%、5%、7%、10%的接种量接入30 mL NYBD培养液中，32℃、160r/min摇床培养24h，每处理重复3次，以不接菌培养液为对照，用分光光度计测定波长600nm处的吸光度值，计算不同接种量处理下培养液的细菌含量。

1.5.5 不同初始pH值对菌株生长的影响

设置pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，28℃、160r/min摇床培养24h，每处理重复3次，以不接菌培养液为对照，用分光光度计测定波长600nm处的吸光度值，计算不同pH值种子液的培养液的细菌含量。

1.5.6 转速对菌株生长的影响

等量接种1.5mL的种子液（1×108CFU/mL）于20mL NYBD培养液中，在32℃条件下，分别80r/min、100r/min、120r/min、150r/min、180r/min摇瓶振荡培养24 h，每处理重复3次，以不接菌培养液为对照，用分光光度计测定波长600nm处的吸光度值，计算不同转速振荡条件下培养液的细菌含量。

全部数据通过SPSS 20.0处理。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌平板筛选和鉴定

在燕麦培养基上通过平板对峙法初筛到31株对烟草疫霉有不同拮抗作用的菌株。通过初筛和复筛，经过综合比较选取其中拮抗效果稍好的细菌菌株做生理生化鉴定，编号为1205抑菌圈直径（含滤纸片）达到了（20.5±0.19）mm。挑取抑菌圈周围的烟草疫霉菌丝制片，对1205菌株显微观察到菌丝溶解，断裂和膨大现象（图1）。

图1 1205 菌株和烟草黑胫病菌对峙培养抑菌带内菌丝变化Fig.1 Mycelium change in bacteriostatic ring of 1205 strains andPhytophthora nicotianae confrontation culture

参考《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）、《常见细菌系统鉴定手册》和《芽孢杆菌属》中有关芽孢杆菌属的描述，对拮抗细菌形态特征进行观察（表1）及生理生化测定（表2），结果表明，拮抗细菌菌体为革兰氏阳性杆菌，均产芽孢，均有鞭毛，初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillussp.）。

以1205菌株的基因组DNA为模板，PCR扩增后经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大约1.5kbp的特异性条带（图2），经过菌株的16S rDNA序列经测定，1205全长1468bp。将1205序列与GenBank中相关数据进行相似性分析的结果表明，在亲缘关系相近的前20个序列都为蜡样芽孢杆菌属（Bacillus cereus）的菌株，综合形态学及生理生化实验可以将其鉴定为蜡样芽孢杆菌。

表1 拮抗细菌的形态观察Table 1 Morphological observation of antagonistic bacteria

表2 拮抗细菌的生理生化反应Table 2 Physiological and biochemical reaction of antagonistic bacteria

图2 1205的PCR扩增产物Fig.2 The PCR amplified products of 1205 strain

2.2 1205菌株发酵条件优化

2.2.1 培养时间对菌株生长及产生抑菌物质的影响

1205的生物量见图3，在2h～6h内急剧增加，8h～12h生长相对缓慢，12h～28h生长趋于平缓，28h后逐渐减少。结果表明，1205菌株的延迟期为0～2h，对数生长期为2h～12h，静止生长期为12h～28h，28h以后进入衰亡期。1205菌株在28h的生物量（OD600nm）为2.812±0.06（Y=9.67X-18.03，R2=0.98），达到最大值，且抑菌物圈也达到最大值，为（10.4±0.11）mm，与其他时间存在显著性差异。因此，综合生物量与抑菌圈直径，选择28h作为1205菌株的最适培养时间。

图3 培养时间对菌株生长及产抑菌物质的影响Fig.3 Effect of culture time on the growth of the strain and antibacterial substance production

2.2.2 温度对菌株生长的影响

该菌株在20℃～40℃范围内均能生长，随着温度的升高生物量先增加后减少（图4），在28℃生物量（OD600nm）为2.728，达到最大值，产生抑菌物质也是在28℃达到最大值（7.5±0.05）mm，且与其他温度存在显著性差异p＜0.05。因此，1205菌株的最适培养温度为28℃。

图4 温度对菌株生长及产抑菌物质的影响Fig.4 Effect of temperature on the growth of the strain and antibacterial substance production

2.2.3 装液量对菌株生长的影响

在160 r/min的转速条件下，随着摇瓶装液量的增加，1205菌株的生物量呈逐渐减少的趋势（图5）。抑菌圈先增加后减少，在20mL时达到最大值（8.14±0.07）mm且与其他装液量存在显著性差异，p＜0.05因此，在160 r/min的转速条件下，综合生物量及抑菌圈直径，1205菌株最适装液量为20mL/100mL。

2.2.4 接种量对菌株生长的影响

在所选取的接种量范围内，1205菌株的生物量随接种量的增加而先增加后减少（图6）。接种量为3%时，菌株的生物量（OD600nm）为2.696±0.03，达到最大值。接种量大于3%时，菌株生物量逐渐减少，且在1%～7%的接种量范围内其生物量及抑菌圈直径均不存在显著性差异p＞0.05，考虑到成本问题，选择1%作为1205菌株的最适接种量。

图5 装液量对菌株生长及产抑菌物质的影响Fig.5 Effect of liquid volume on the growth of the strain and antibacterial substance production

图6 接种量对菌株生长及产抑菌物质的影响Fig.6 Effect of inoculation amount on the growth of the strain and antibacterial substance production

2.2.5 不同初始pH值对菌株生长的影响

1205在pH5.0～8.0均能较好的生长，pH 8.0以上生长开始降低。在pH5.0、pH6.0和pH8.0时其生物量与抑菌圈直径最大且不存在显著性差异p＞0.05，因此，表明该菌的最适生长pH值在偏酸偏碱范围内。在实际实验操作中，培养基的自然pH值为6.0，因此，选择pH6.0作为其最适起始pH值。

图7 不同初始pH对菌株生长及产抑菌物质的影响Fig.7 Effect of initial pH on the growth of the strain and antibacterial substance production

2.2.6 转速对菌株生长的影响

该菌株的生物量随转速的增加而先增加后减少（图8）。在转速为180r/min时1205菌株的生物量为OD值2.733±0.05达到最大值，同时产抑菌物质也最大为（8.808±0.09）mm，但与160r/min和200r/min时不存在显著性差异p＞0.05，考虑能源成本问题，选择160r/min作为1205菌株的最适摇瓶转速。

图8 转速对菌株生长及产抑菌物质的影响Fig.8 Effect of rotational speed on the growth of the strain and antibacterial substance production

通过研究该株拮抗细菌的最佳发酵条件，表明1205菌株摇瓶振荡的最适培养条件为：培养基为NYBD，接种量为1%，初始pH值为6.0，培养温度为28℃，装液量为20mL/100mL，摇床转速为160r/min，培养时间为28h。此条件下生物量（OD600nm）为2.937±0.03，抑菌圈达到（10.6±0.15）mm，效果显著。

3 讨论

有研究表明，对烟草疫霉有拮抗作用的细菌有芽孢杆菌（Bacillusspp.）和假单胞杆菌（Pseudomonasspp.），除细菌以外，土壤真菌中的青霉（Penicillumspp.）、木霉（Trichodermaspp.）等也是常见的拮抗菌[12]。但芽孢杆菌属细菌具有抗菌谱广、生长快、抗逆性强、使用安全、抗菌物质活性高、易于进行分子加工等特点[13-14]，本实验中的蜡样芽孢杆菌1205 在对黄瓜枯萎病菌具有良好的抑制作用，且抑菌特性稳定，对外界环境有很强的耐受性和适应性[15-16]。其他方面，对烟草黑胫病防治报道很少。

本实验以NYBD作为1205菌株发酵条件优化的基础培养基，对拮抗细菌菌株1205温度、pH值、转速、等进行优化，进一步提高了发酵液中菌体的产生量，为工业化生产和大面积推广应用提供理论依据。本研究仅涉及发酵条件对拮抗细菌菌体产生量和抑菌活性的影响，下一步将对其在拮抗作用机制和抗菌物质的有效成分等相关工作进行系统、具体的研究，预期今后在防治烟草疫霉方面有更加突出的价值。拮抗细菌1205实际大田生防效果正在研究，为今后田间烟草疫霉病生防制剂的开发提供坚实基础。

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