纳豆激酶液体发酵条件优化的研究

王艳艳，邓启华

（北京燕京啤酒股份有限公司技术中心，北京 101300）

纳豆激酶（Nattokinase）是1987年由日本学者从纳豆中提取的一种丝氨酸蛋白酶，该酶不仅具有明显的溶栓能力，还可以激活体内的纤溶酶原，从而增加内源性纤溶酶的量与作用[1-3]。目前临床上使用的治疗心脑血管栓塞的药品如尿激酶（urokinase，UK），链激酶（streptokinase，SK），组织型纤溶酶原激活物（tissue-type plasminogenactivator，tpA）等均在不同程度上存在一定的缺陷（毒性较强，副作用较大；体内半衰期短，难以发挥药效；来源紧缺，价格昂贵），而纳豆激酶有望弥补这些缺陷，成为新一代的溶栓药物[4-8]。纳豆激酶是纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilisNatto）的代谢产物，纳豆激酶的生产普遍采用固体发酵大豆制备纳豆，然后从纳豆中分离纯化的方法得到，而在固体发酵过程中染菌，散热问题一直未能得到很好的解决[9-10]。相对而言，纳豆激酶液体发酵生产工艺简单，成本低廉，因此进行纳豆激酶液体发酵工艺的研究是非常有必要的，而对纳豆激酶液体发酵条件进行全面优化是这一研究工作的关键所在。

本实验对纳豆激酶的液体发酵条件进行了系统研究，通过正交试验确定最佳发酵培养基，并运用响应面分析法对发酵条件进行了优化，利用Box-Benhnken的中心组合试验设计，对试验数据进行响应面分析[11-12]，并对拟合数学模型进行了较为详细的描述，最终对纳豆激酶液体发酵工艺进行了优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

纳豆芽孢杆菌来自于燕京中发生物技术有限公司。

1.1.2 试剂

蚓激酶：中国药品生物制品检定所；凝血酶、纤维蛋白原：中国食品药品检定研究院；琼脂糖、葡萄糖、木糖、玉米淀粉、大豆蛋白胨、动物蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2及MgSO4·7H2O等均为国产试剂。

1.1.3 培养基

斜面培养基：平板计数培养基。

种子培养基：营养肉汤培养基。

基础培养基：葡萄糖2%，大豆蛋白胨4%，KH2PO40.1%，K2HPO40.1%，CaCl20.02%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.0～7.2。

培养条件：从斜面上挑取一环菌苔接入种子培养基中，37℃、150r/min振荡培养至对数期，随后将种子液按一定比例接种于装有100mL培养基的500mL锥形瓶中，培养48h结束后离心取上清液测定酶活。

1.2 仪器与设备

ZHWY-111C型恒温培养振荡器：上海智诚分析仪器制造有限公司；5804R型离心机：德国Eppendorf公司；LDZH-150KBS立式压力灭菌器：上海申安医疗器械厂；SPECORD205型紫外可见分光光度计：德国Anylytikjena公司；8417型pH计：意大利Hanna公司；BX-240H电子天平：日本岛津公司；LRH-250生化培养箱：日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 绘制纳豆芽孢杆菌的生长曲线

将培养好的种子液接入基础培养基中，37℃、150r/min振荡培养，每隔2h取样，以未接种的培养基为空白，测波长600nm处的吸光度值（OD600nm），绘制纳豆芽孢杆菌的生长曲线，根据纳豆芽孢杆菌的对数生长期确定最适种龄。

1.3.2 发酵培养基配方的优化

发酵培养基的碳氮源及碳氮比优化：通过单因素试验对基础培养基的碳、氮源及碳氮比进行了初步研究，确定出产酶量比较高的3种碳源、氮源及碳氮比。在此基础上采用L9（34）正交试验法对碳源、氮源及碳氮比3个影响因素进一步研究，最终确定出发酵培养基的最佳碳氮源配方。

发酵培养基的无机盐浓度优化：采用L9（34）正交试验对基础培养基的无机盐（MgSO4，CaCl2及K2HPO4/KH2PO4）的浓度进行优化，确定出发酵培养基的最佳无机盐组成。

1.3.3 响应面分析法确定最佳液体发酵条件

以优化后的发酵培养基培养纳豆芽孢杆菌，通过单因素试验对发酵的条件（接种量，装液量，发酵温度，初始pH值）进行初步分析，随后依据Box-Benhnken试验设计对发酵条件进行3因素3水平的响应面分析试验，包括12个析因试验和3个中心试验。利用统计软件Minitab15[13-14]对试验数据进行分析，确定出最佳发酵条件。

1.3.4 纳豆激酶活力测定

纳豆激酶的酶活采用琼脂糖纤维蛋白平板法[15]进行测定，以蚓激酶作酶活的标准曲线。

1.3.5 酶活定义酶活定义为：在37℃，pH 7.8的条件下，1min内溶解1μmol纤维蛋白所需的酶量为1U。

2 结果与分析

2.1 纳豆芽孢杆菌的生长曲线

从发酵开始连续测定OD值大约30h，最终得到的纳豆芽孢杆菌的生长曲线见图1。

由图1可知，纳豆芽孢杆菌在0～6h时为停滞期，6h后开始进入对数期，大约至24h时对数期结束。由于纳豆芽孢杆菌在对数生长期时菌体生命力极为旺盛，此时将种子液进行转接既可以避免生长缓慢、发酵周期过长，又不会导致菌体过早自溶，因此可以确定纳豆芽孢杆菌在种子液中培养18h～20h后接入发酵培养基中最为适宜，选取18h～20h作为纳豆芽孢杆菌的种龄。

图1 纳豆芽孢杆菌的生长曲线Fig.1 The growth curve ofBacillus subtilis Natto

2.2 发酵培养基的确定

2.2.1 发酵培养基的最佳碳氮源及碳氮比确定

通过前期的单因素试验确定出相对产酶量比较高的碳源为玉米淀粉、葡萄糖、木糖；比较适宜的氮源为大豆蛋白胨、动物蛋白胨及大豆粉；碳氮比确定为4%/2%、4%/4%、2%/4%。采用正交试验对发酵培养基的碳源、氮源及碳氮比进行了优化。正交试验因素水平见表1，试验结果见表2。

表1 发酵培养基碳氮源配方正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test for the optimization of carbon and nitrogen formula in the medium

表2 发酵培养基碳氮源配方正交试验结果Table 2 Results of the orthogonal test for the optimization of carbon and nitrogen formula in the medium

由表2可知，3个因素对产酶影响的顺序为A＞B＞C。由k值得到的最佳配比为玉米淀粉2%，动物蛋白胨4%；从表2结果来看，酶活最高的配比为玉米淀粉4%，动物蛋白胨4%。

对这2种碳氮源配比进行发酵验证试验，试验结果见表3。

表3 发酵培养基碳氮比配方正交试验验证试验Table 3 Verification test of the orthogonal test for the optimization of carbon and nitrogen formula in the medium

由表3可知，通过验证试验确定最佳碳氮源配比为玉米淀粉2%，动物蛋白胨4%。

2.2.2 发酵培养基的无机盐浓度确定

微生物在生长繁殖和生产过程中，需要某些无机盐和矿物质元素作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物。这些物质一般在低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用。因此选择合适的无机离子浓度是非常重要的。在众多无机离子中，钾、钙、镁等阳离子是许多酶的激活剂，影响蛋白质的合成。通过正交试验研究了MgSO4·7H2O，CaCl2及K2HPO4/KH2PO4对产酶的影响，因素水平见表4，试验结果见表5。

表4 发酵培养基无机盐浓度正交试验因素水平Table 4 Factors and levels of the orthogonal test for the optimization of medium inorganic concentration

表5 发酵培养基无机盐浓度正交试验结果Table 5 Results of the orthogonal test for the optimization of medium inorganic concentration

由表5可知，CaCl2对产酶有明显的促进作用。通过k值得到无机盐的最佳浓度为MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO40.1%/0.1%。由正交试验直观分析结果可知，产酶最高的无机盐浓度为MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO40.3%/0.1%。对所得结论进行验证试验，试验结果见表6。

表6 发酵培养基无机盐浓度的验证试验Table 6 Verification test of the medium inorganic salt concentration

由表6的酶活结果来看，最佳的无机盐浓度为MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO40.3%/0.1%。

通过正交试验确定了纳豆激酶液体发酵的最佳培养基为玉米淀粉2%，动物蛋白胨4%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO4为0.3%/0.1%。

2.3 响应面分析法确定最佳液体发酵条件

以优化后的培养基液体发酵纳豆芽孢杆菌，通过单因素试验考察了接种量、装液量、发酵温度、初始pH值对产酶的影响。由单因素试验结果可知，最佳装液量为50mL/500mL锥形瓶。接种量、发酵温度、初始pH值对产酶影响显著。

根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，并结合单因素试验结果，进行3因素3水平的响应面分析试验。因素水平见表7。

表7 响应面试验因素与水平Table 7 Factors and levels of the response surface test

以接种量（A）、发酵温度（B）、初始pH值（C）为自变量，以培养48h后测得纳豆激酶酶活为响应值（Y），进行响应面分析，试验方案及结果见表8。

利用Minitab15对试验数据进行二次多项回归拟合，建立二次响应面回归模型，优化各因素水平。具体的分析结果见表9、表10。

由表9可知，B的线性项，A、B、C的平方项对纳豆激酶酶活具有显著作用。另外，B与C的交互作用也是比较显著的。该模型的决定系数R2=0.912，说明回归方程的拟合程度较好。根据表9得到纳豆激酶酶活（Y）对接种量、发酵温度、初始pH值的二次回归方程式：

表8 响应面分析方案及试验结果Table 8 Scheme and results of the response surface test

表9 纳豆激酶酶活的估计回归系数Table 9 Estimated regression coefficient of Natto kinase activity

表10 纳豆激酶酶活的估计回归系数表的方差分析Table 10 Variance analysis of estimated regression coefficient of Nattokinase activity

由表10可知，该模型的p值为0.003，小于0.01，说明该模型的回归显著。失拟的p值为0.072，大于0.05，这说明该模型的失拟不显著。

利用Minitab15所生成的响应曲面分析图见图2～图4。

图2 纳豆激酶酶活与发酵温度，接种量的曲面图及等值线图Fig.2 Response surface and contour plot of natto kinase activity,fermentation temperature,and inoculation size

图3 纳豆激酶酶活与初始pH值，接种量的曲面图及等值线图Fig.3 Response surface and contour plot of natto kinase activity,initial pH and inoculation size

图2～图4表明，当某一因素达到最佳水平时，其他2个独立因素之间的相互作用。从3个响应面曲面图看出，发酵温度对纳豆激酶酶活的影响比较显著。由相应的等高线图可知，发酵温度与接种量、初始pH值与接种量的等高线图接近圆形，交互作用不显著，而发酵温度与初始pH值的等高线图呈椭圆形，交互作用显著。

图4 纳豆激酶酶活与初始pH值，发酵温度的曲面图及等值线图Fig.4 Response surface and contour plot of natto kinase activity,initial pH and fermentation temperature

由Minitab15对回归方程进行分析得到优化后的条件：接种量3.14%，发酵温度36.05℃，初始pH值为6.83。为方便操作，优化后的条件改为接种量3.1%，发酵温度36℃，初始pH值为6.8。纳豆激酶酶活的最大估计值为32.22kU/mL。在所得的优化条件下进行3次验证试验，所得的纳豆激酶酶活分别为31.32kU/mL、33.25kU/mL、33.61kU/mL，平均值为32.73kU/mL，实验值与理论预测值非常接近，这说明该模型可以较好地预测实际发酵情况，并证明了利用响应面优化纳豆激酶液体发酵条件的可行性。

3 结论

本实验利用正交试验法和响应面分析法对纳豆激酶液体发酵条件进行了系统研究。通过监测纳豆芽孢杆菌的生长曲线确定出18h～20h为最适种龄。利用正交试验对培养基组成进行了优化，确定出发酵的最佳培养基为玉米淀粉2%，动物蛋白胨4%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO40.3%/0.1%。随后由响应面分析法对纳豆激酶液体发酵条件进行了优化，根据Box-Benhnken试验设计建立了发酵条件的二次多项数学模型，并利用Minitab15软件对模型进行了显著性检验，得到了优化后的发酵条件：初始pH值为6.8，装液量50mL/500mL锥形瓶，接种量3.1%，发酵温度36℃。经过优化，发酵48h后的纳豆激酶酶活从12.47kU/mL提高为32.73kU/mL。

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