MIR-124对人结肠癌SW620细胞生长与侵袭的影响

唐玉兰，梁庆模，莫清华，金 军

(1衡阳市第一人民医院，湖南衡阳421002;2南华大学附属第一医院)

目前，有关miRNA与结肠癌的报道较多，研究发现，miR-143、miR-320、miR-200c 等可通过靶向不同的靶基因抑制结肠癌细胞的生长、侵袭、转移［1～4］。miR-124 在肝癌和宫颈癌组织中表达下调，可通过靶向CDK6抑制髓母细胞瘤细胞的生长与浸润，也可通过靶向ITGB1抑制口腔鳞状细胞癌的生长［5～9］。然而，关于 miR-124在结肠癌中的表达情况、生物学功能以及参与结肠癌发生发展的作用机制尚不明确。2010年9月～2012年6月，本研究采用 MTT、细胞划痕、Transwell侵袭实验观察miR-124在人结肠癌SW620细胞中的生物学行为，为进一步阐明结肠癌发生、发展、浸润、转移的分子机制提供实验依据，为结肠癌的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料 人结肠癌SW620细胞，来自南华大学肿瘤研究所。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养 人结肠癌SW620细胞培养于含体积分数为10%的灭活小牛血清(BSA)RPMI 1640培养基(Hyclone，美国)中，在37℃、5%CO2的培养箱(Forma，美国)内培养传代。细胞呈单层生长，铺满培养瓶后传代;传代时常规倒掉培养液，用胰蛋白酶消化;在倒置显微镜(Olympus，日本)下观察，发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即倾去胰酶，加适量含血清培养液吹打成单细胞悬液，按所需浓度接种。

1．2．2 细胞转染 miR-124成熟体用于转染后上调细胞内miR-124表达，转染浓度为40μmol/L。接种细胞于6/96孔板或50 mL培养瓶中，在完全培养基中细胞生长至30% ～50%;在无菌EP管中，采用Lipofectamin 2000TM转染;室温下放置 20 min，使DNA与脂质体形成复合体，用无血清培养液洗涤培养瓶中的细胞。往复合体中加入无血清的培养液(不含抗生素)，温和混匀，加入到待转染的6/12/24/96孔板或50 mL培养瓶中;置于37℃、5%CO2培养箱中，放置24～48 h。同时，设置miR-124阴性对照。

1．2．3 细胞生长能力观察 采用MTT实验。培养转染miRNA以及对照的细胞达到75%～80%密度时，D-Hanks液洗2遍。消化细胞，制成单细胞悬液并进行细胞计数。接种细胞于96孔板中，每孔体积200μL接种3×103个细胞，重复6孔。37℃、5%CO2培养箱培养24～72 h，每孔加5 mg/mL的MTT液20μL呈色。37℃、5%CO2培养箱继续孵育4 h，终止并去除培养液。每孔再加入150μL DMSO，振荡10 min，使结晶物溶解。选择490 nm波长，MTT比色，测定各孔吸光度值并记录结果。实验重复3次，绘制MTT曲线。

1．2．4 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。将瞬时转染miR-124成熟体和阴性对照的细胞接种于6孔板，待之长至临近饱和。用10μL的Eppendorf Tip消毒后在细胞板上划痕，并将细胞洗涤2～3遍。加含5%小牛血清的DMEM培养基，倒置显微镜下观察24、48 h各组细胞的变化并摄像。测量各组细胞任意3个部位的不同伤口的宽度，测算0 h与12、24 h的伤口愈合率，即0 h伤口宽度与12、24 h伤口宽度的差值与0 h伤口宽度的比值。计数3组实验的平均值，并进行统计分析。

1．2．5 细胞侵袭能力观察 采用Transwell侵袭实验。用镊子夹住 Transwell小室浸泡在 500μL 1∶100基质胶中约5 min，取出 Transwell并晾干;将Transwell放入24孔板中，过夜干燥。在Transwell的上室内加入50μL基质胶，加入200μL无酶水/孔，直至干燥。待细胞长至80%，加入MEM培基(含5%胎牛血清)。将Tranwell预热至37℃，每孔加入200μL侵袭缓冲液(2 mL BSA+38 mL RPMI 1640培基)，37℃放置1 h。无血清培基洗涤后消化，1 000 r/min离心5 min，收集细胞。有血清的培基重悬细胞沉淀后，1 000 r/min离心5 min，放置细胞15 min。PBS洗2次，1 000 r/min离心10 min，5 mL侵袭缓冲液重悬细胞，调整细胞数为2．5×105/mL。通过间隙加入800μL Fibronectin Solution到下腔。在上腔内加入200μL细胞悬液，在过滤器上均匀布满后放入培养箱培养36～38 h。10%甲醛中固定Transwell 10 min，自来水清洗2次。将Transwell加入结晶紫中5 min，自来水清洗后放入40℃温水泡10 min。将培养小室倒置晾干中性树胶封片，在光学显微镜下观察、照相。随机选取4个低倍视野(×100)进行细胞计数，并计算平均值。实验结果重复3次。

1．2．6 统计学方法 采用SPSS13．0统计软件。实验结果以¯x±s表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 miR-124对细胞生长能力的影响 MTT实验检测miR-124对人结肠癌SW620细胞生长的影响，转染miR-124成熟体及其阴性对照24、48、72 h后，人结肠癌SW620细胞OD值分别为0．287±0．010、0．353 ±0．006、0．376 ±0．007，对照组分别为 0．436±0．014、0．551 ± 0．015、0．642 ± 0．021，P 均 ＜0．05。

2．2 miR-124对细胞迁移能力的影响 划痕实验检测miR-124对人结肠癌SW620细胞运动能力影响，转染miR-124成熟体12、24 h后伤口愈合率分别为26．5% ± 0．7%、37．7% ± 1．5%，其阴性对照分别为 40．6% ±2．5%、78．2% ±1．6%，P 均 ＜0．05。见插页Ⅱ图6。

2．3 miR-124对细胞侵袭能力的影响 Transwell侵袭实验检测miR-124对人结肠癌SW620细胞穿膜能力的影响，转染miR-124成熟体及其阴性对照24 h后，穿过基底膜的SW620细胞数分别为(37±2．6)个和(80 ±3．6)个，P ＜0．05。见插页Ⅱ图7。

3 讨论

结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，在所有恶性肿瘤中发病率居第3位，且其发病率每年呈上升趋势。全世界每年新发结肠癌大约有120万例，我国结直肠癌的发病率和病死率增长迅速，部分城市已经达到或超过西方发达国家水平，成为仅次于肺癌的高发恶性肿瘤［10］。目前，对于结肠癌的形成、发展、预后以及治疗都有了新的认识，但要治愈和预防结肠癌的发生，关键问题是了解结肠癌的病因及发病机制。但是，仍然有较多的患者因为缺乏有效的治疗手段而死亡，因此，很有必要进一步研究结肠癌的致癌效应并寻找出新的治疗策略。

miRNA的表达失调或功能异常，可能导致包括肿瘤在内的多种疾病的发生。越来越多的研究显示，在人类肿瘤中存在miRNA表达失调，miRNA发挥癌基因和抑癌基因的功能参与细胞增殖、凋亡和分化的调控，在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的生物学功能［2，3］。Ghanta 等［11］通过自己建立的人类miRNA疾病数据库整理出几十个致瘤miRNA和抑瘤miRNA，并对其功能、表达、进化、基因组分布、靶基因及转录因子等进行了全面的系统生物学分析，发现在功能上致癌miRNA更倾向于促进细胞增殖、抑制凋亡、抑制免疫细胞发育、控制细胞周期等，而抑癌miRNA更倾向于抑制细胞生长、促进凋亡等。关于miRNA可作为癌基因或抑瘤基因参与肿瘤发生、发展的报道越来越多。文献表明，miR-124在肝癌和宫颈癌组织中表达下调，miR-124可通过靶向CDK6抑制髓母细胞瘤细胞的生长与浸润，也可通过靶向ITGB1抑制口腔鳞状细胞癌的生长［5～8］。miR-124 与 miR-137 能促进 CD+133肿瘤干细胞的分化，抑制癌细胞的增殖，细胞周期蛋白激酶CDK6是它们的作用靶点［9］。因此，miR-124可能作为抑癌miRNA参与肿瘤的发生、发展。鉴于此，我们在下一步的课题中，深入miR-124在结肠癌中研究将可能进一步了解结肠癌的分子病理机制。本研究结果表明，miR-124可显著抑制人结肠癌SW620细胞生长及运动能力，过表达miR-124可显著抑制人结肠癌SW620细胞的侵袭能力。因此，我们初步推测miR-124在结肠癌中可能发挥抑癌基因的作用。

综上所述，miRNA作为癌基因或抑癌基因功能的发现为肿瘤病因及发病机制的研究提供了新思路，也为肿瘤预防及肿瘤分型、诊断、预后判断、指导用药、疗效监测甚至辅助治疗提供了新策略［12，13］。继续深入miR-124与结肠癌关系的研究，阐明miR-124参与结肠癌发生、发展的分子机制，可为结肠癌的防治提供理论依据和实验基础。

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