抗溶酶体相关膜蛋白2抗体在抗中性粒细胞胞质抗体相关血管炎肾损害中的研究进展

研究背景

抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)的发现对于血管炎的研究具有里程碑的意义，自30年前ANCA首次在坏死性肾小球肾炎患者血清中发现以来[1]，其在血管炎中的地位逐渐被证实。Watts等[2]首次提出将小血管壁的炎症和纤维素样坏死、血清中ANCA的阳性、免疫抑制治疗有效等为特征的三种疾病——韦格纳肉芽肿(WG) 、显微镜下多血管炎(MPA) 、变应性肉芽肿性血管炎(CSS)，统称为ANCA相关性血管炎(AAV)。目前将特发性坏死性新月体性肾小球肾炎(NCGN)也纳入AAV范畴。AAV累及肾脏称为ANCA相关性肾炎,累及率约80%，累及率又随疾病的不同而异[3]。AAV发生率及致死率较高，经治疗85%患者可缓解，该病易进入反复缓解复发状态，约50%的患者5年内反复复发，约20%的患者在发病5年内进入终末期肾病[4]。人溶酶体相关膜蛋白2(hLAMP-2)是一种糖基化的1型糖蛋白，表达于中性粒细胞、内皮细胞等不同细胞溶酶体膜上，hLAMP-2免疫表位与大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌的黏附蛋白——Ⅰ型菌毛蛋白H(FimH)有高度一致性[5]，用FimH免疫大鼠后获得的抗体能够同hLAMP-2交叉反应，并通过分子模拟作用导致大鼠发生 NCGN。抗hLAMP-2抗体是新近发现的一种ANCA亚型，与AAV关系密切，成为近年研究的热点。本文就细菌感染、分子模拟致病及抗hLAMP-2抗体在AAV中的作用展开综述，以期加深对AAV发病机制的认识。

AAV病因及发病机制

AAV的病因及发病机制目前并不十分清楚，近年随着研究的深入，在以下方面取得较大进展：(1)ANCA 的直接致病作用被大量体外实验及临床研究证实[6,7]，但PR3-AAV动物模型尚不能成功建立，可能有其他复杂的免疫因素参与[8]。(2)T细胞及其调节作用在AAV中逐步被认识[9]，针对利用T细胞治疗AAV，从而进一步证实T细胞在AAV中的作用[10]。(3)B因子、C3 等补体系统的激活，释放其裂解产物C5a，与C5a受体结合致敏中性粒细胞，对中性粒细胞招募和激活起级联放大效应，导致小血管壁发生严重的坏死性炎症[11]，支持补体系统参与疾病进展。(4)目前已知的多种基因编码的蛋白质能够参与 AAV免疫反应，如人类白细胞抗原(HLA) 蛋白 PTPN22、 CTLA4 等[12]，特别是Lyons等[13]的研究初步证实PR3-AAV和MPO-AAV在基因水平上是不同的自身免疫综合征，这位为AAV的分类提供基因的依据。(5)微生物的感染一直是AAV的研究热点，新近的研究在细菌诱导AAV发生和发展中的作用提出新的观点，有研究发现[14]，在PR3-AAV患者的血清中互补PR3中段和金黄色葡萄球菌蛋白之间存在同源性，如暴露于金黄色葡萄球菌环境下，可诱导抗PR3自身抗体产生，该抗体通过抗独特型反应,诱导抗PR3 抗体的产生，引起AAV发病。Kain等[5]的研究提示细菌感染可能通过分子模拟产生抗hLAMP-2抗体，并导致NCGN发病。这些研究进展进一步加深了AAV的病因及发病机制的认识，为进一步的治疗提供依据。

LAMP-2的生物学特征

LAMPs的分子生物学LAMPs是一种高度糖基化的蛋白质，它覆盖在溶酶体膜的表面，其主要由同源的Ⅰ型跨膜蛋白LAMP-1和LAMP-2组成，其结构首先被Burnside等[15]发现，但直到1985年LAMP-2的单克隆及多克隆抗体制备成功，LAMP-2结构才被更清楚地认识[16]，LAMP-2为一种跨膜糖蛋白，由N端头区、跨膜区和C端的尾区组成[17]，C端尾区中的保守区域由11 个氨基酸残基组成,N 端腔内头区含16～20 个糖基化位点,铰链区有与氧基相连的多聚糖，N 端的糖基化具有稳定溶酶体膜蛋白的作用，糖基化的程度与细胞的类型及活化状态有关。LAMP-2多肽分子量为40～45 kD，而糖基化后的LAMP-2分子量约120 kD,编码基因位于性染色体Xq24- q25[18]，其基因由 9个外显子组成,第1～8 号外显子和部分第9号外显子编码N端头区,9号外显子余下部分编码跨膜区和C端尾区。LAMP-2基因由于不同剪切可生成3种亚型——LAMP-2A、LAMP-2B和LAMP-2C[19]，他们有相同的膜外部分，三个亚型均存在作为靶抗原必需的氨基酸序列。但是跨膜膜内部分不同，这影响其分布及功能[20],LAMP-2A和LAMP-2C主要分布于肝脏、肺等组织内，而LAMP-2B主要分布于心肌和骨骼肌的溶酶体膜上。

LAMP-2生理作用LAMP-2对健康极为重要，它是维持溶酶体膜的完整性蛋白之一,LAMP-2与LAMP-1糖蛋白复合物充分地覆被在溶酶体膜上，应用siMRA技术去除LAMP-2后溶酶体膜的通透性增加，导致溶酶体的完整性破坏和细胞的死亡[21,22]。同时LAMP-2的缺乏导致中性粒细胞防御功能部分丧失，增加牙齿的齿菌斑积累而导致严重的牙周炎[23]。

LAMP-2缺失的致病机制如下：(1)LAMP-2与自体吞噬有关，LAMP-2基因突变导致自噬小体的自体吞噬功能缺陷。(2)LAMP-2可控制分子伴侣介导的自噬的活性，这是一种对应激的主要防御机制[24]；近来研究发现,LAMPs 参与溶酶体膜与自噬小体的融合过程,当将吞噬小体受体转染给胚胎纤维母细胞时则赋予其吞噬能力，LAMP-2 基因敲除后虽未损害溶酶体吞噬液体颗粒的能力,却不能吞噬单体鸟苷三磷酸(GTP)酶或细菌至溶酶体，在中性粒细胞中观察发现,LAMP-2 缺失会引起相似的溶酶体和自噬小体融合障碍[25]，此研究结果表明LAMP-2表达的缺失选择性的阻断了非氧依赖的,以溶酶体为中心的杀菌途径。(3) LAMP-2基因突变导致细胞器运动力丧失。对LAMP-1与LAMP-2双重缺陷的小鼠进一步研究发现，自噬小体与溶酶体向微管组织中心迁移时间延迟,动力蛋白依赖性的移动促进溶酶体与自噬小体融合,而两者运动力减低或许是自噬小体成熟障碍的一个直接原因，LAMP-2 可能通过某种微妙的机制调节着自噬小体的成熟。(4)LAMP-2对抗原的递呈起重要作用，特别是把细胞质抗原通过组织相容性Ⅱ类分子递呈给CD4+的T辅助细胞[26]。以上研究表明LAMP-2有其重要的生理功能，但抗LAMP-2的抗体是否干扰LAMP-2的功能目前不得而知。

抗LAMP-2抗体与AAV

抗LAMP-2抗体在AAV患者中的发现1995年,Kain等[27]在AAV患者血清中首先鉴定出抗hLAMP-2抗体的存在，通过免疫印迹法将纯化的肾小球及中性粒细胞中膜蛋白与AAV血浆结合，分别发现在中性粒细胞中分子量为80～110 kD/170 kD和肾小球细胞中分子量为130 kD糖蛋白，这种分子量大小的差别反应了在两种类型细胞中的hLAMP-2糖基化程度的不同，在这项小样本的研究中，抗体与不同糖基化水平的hLAMP-2的结合不受影响。Kain等[5]进一步研究表明通过重组hLAMP-2在大肠埃希氏菌及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达，所有患者的抗hLAMP-2抗体能够识别糖基化及非糖基化形式的hLAMP-2分子，这证实了抗体可识别天然糖基化的hLAMP-2膜外区域蛋白骨架上的表位。通过应用患者的IgG标记识别表位，基于其氨基酸序列位置，结合表位定位在P41～49 和P331～341。有趣的是P41～49表位氨基酸序列与FimH氨基酸序列100%的同源性(90%完全一致)，而FimH是一种具有一型纤毛细胞(如大肠杆菌)的细菌黏附分子，FimH可与hLAMP-2抗体起交叉反应，应用FimH免疫大鼠可诱导抗LAMP-2抗体的合成，这揭示两种分子间分子模拟的存在。

抗LAMP-2抗体及其类似物在实验动物中的致病作用为证明这种新发现的抗hLAMP-2抗体致病性，Kain等[5]通过注入抗hLAMP-2抗体或分子类似物通过抗原激活免疫诱导损伤，从而同来检测抗hLAMP-2抗体潜在的致病性。研究发现大鼠在注射抗hLAMP-2抗体2h后在肾小球内皮细胞中可测出其存在，24h后其滴度在循环中迅速降低，随后不能测出；且大鼠发生血尿、严重的蛋白尿和约25%大鼠发展成寡免疫复合物节段坏死性肾小球肾炎，而注入正常兔子球蛋白的大鼠未发生此类损伤。Roth等[28]也应用WKY大鼠构建了实施被动免疫研究，但没有发现抗hLAMP-2抗体在肾小球沉积或导致肾小球肾炎。对不同结果的最可能的解释是应用抗hLAMP-2抗体的不同。而在FimH和hLAMP-2交叉免疫反应则提供了证实抗LAMP-2抗体致病性的机会，因为共同的hLAMP-2/FimH表位可以被患者的抗体所识别，应用重组的FimH免疫大鼠产生抗FimH抗体，可以与人及大鼠的LAMP-2反应，并能导致寡免疫复合物节段坏死性肾炎，这个研究证实应用FimH免疫可导致FNGN，至少在实验条件下证实两种分子模拟致病的存在。在AAV患者中也发现带有FimH的细菌感染的高发生率。Kain等[5]报道13例患者有9例在近3月有含有FimH的细菌感染，在Roth等[28]研究中有12%的患者有大肠埃希氏菌感染，均提示带有FimH的细菌感染是AAV致病的原因之一，但需要更大规模的随机对照多中心的研究去证实在人类中含FimH的细菌感染是否能诱导抗hLAMP-2抗体的产生，并发生AAV。

抗hLAMP-2抗体的检测方法对抗hLAMP-2抗体的检测目前仍是一个挑战。认识hLAMP-2的表位的特征，糖基化水平对表位结合的影响，是临床抗hLAMP-2抗体的检测的关键。目前以hLAMP-2作为抗原的方法有：(1)初期研究中应用的天然纯化的糖基化抗原，由于量非常少，获得困难，目前极少使用。(2)重组的hLAMP-2抗原，在大肠埃希氏菌表达的重组糖基化的hLAMP-2不如表达在哺乳动物的细胞内的hLAMP-2稳定，但是不易大规模的获得，且其糖基化水平与其表达的变异性和表达细胞的类型均相关。通过转基因方法能增加hLAMP-2的表达，但会导致糖基化的变异性和不确定性，和生理情况下并不同，这对其与抗体的结合的影响是不可预测的[5,28,29]。(3)间接免疫荧光法(IIF)通过hLAMP-2与抗体结合而检测出抗体，细胞表面稳定的表达全长的hLAMP-2已经通过hLAMP-2A转染IdID细胞实现，可通过IIF去量化hLAMP-2抗体[5]。

抗hLAMP-2抗体检测在AAV患者中意义Kain等[27]最早的研究发现抗hLAMP-2抗体的阳性率是87%(13/15),但由于患者太少而不能评估出AAV患者的一般的阳性率。Kain等[5]通过一组84例肾活检诊断为寡免疫复合物节段坏死性肾炎的队列研究证实，其中78例(93%)患者通过非糖基化重组hLAMP-2应用ELISA方法检测到抗体阳性，同时应用其他两种方法证实。而在同一组患者中通过免疫抑制剂治疗缓解后患者抗hLAMP-2抗体仅6例阳性(7%)，在其他30例肾脏疾病对照组中有1例阳性，健康对照组53例均为阴性。

随后Kain等[29]研究中抗hLAMP-2抗体高阳性率被进一步确认，在欧洲三组队列研究中的未治疗的AAV患者抗hLAMP-2抗体的阳性率分别是81%、91%、80%，其阳性率是抗MPO和抗PR3抗体的两倍，在8例ANCA阴性患者血浆中有7例测得抗hLAMP-2抗体的阳性，所有患者的血浆都分别用三种方法分别检测(ELISA、immunoblot和IIF)，三种方法的一致性超过了80%。

抗hLAMP-2抗体与抗MPO和PR3 ANCA对治疗的反应不同，在一项纵向研究中Kain等[29]研究发现，43例患者中有42例在治疗一月后抗体消失，在后来的随访中没有临床复发的患者抗hLAMP-2抗体保持阴性，进一步证实在临床缓解中的病例其抗体是测不出的。与之形成对比的是在患者临床缓解后经典的ANCA通常仍然存在。抗hLAMP-2抗体在免疫开始治疗后阳性率迅速降低，而在28例患者中有18例(57%)在疾病复发前抗hLAMP-2抗体从阴性变为阳性，这强烈的提示其与疾病的活动有关，但需要更多的数据证实。

临床研究比较比较4篇抗hLAMP-2抗体在AASV的临床研究，Kain等[5,27,29]的三项研究高度一致，而Roth等[28]研究与上述研究结果矛盾，从而引起了学者的关注，分析其结果差异可能的原因[30-32]，从而发现其结果的差异与入组病例不同和选择的检测方法不同密切相关。Kain等[5,27,29]的研究高度的一致性可能是因为所有hLAMP-2抗体均应用多种方法检测，这三项研究在未经激素和免疫抑制剂治疗的AAV患者的抗hLAMP-2抗体的阳性率在80%～90%，总阳性率89%(155/173)。

目前仅Roth等[28]研究与上述研究结果矛盾，总体的患者抗hLAMP-2抗体的阳性率仅21%。但这个数据包含了活动期及静止期的患者，进一步比较两组的入选患者及研究方法。Roth等[28]研究中103例来自北卡罗莱纳州大学肾病中心(UNC)患者的抗体分别通过ELISA、Western Blot和IIF三种方法检测，226例来自波士顿医院的患者应用了一种新的商业可获得的hLAMP-2多肽片段，仅仅包含膜外1/4的序列。仔细分析UNC患者的选择和分组方法，依据血管炎的严重程度和疾病活动情况进行临床疾病活动指数打分(BVAS)，患者被分为两组：一组是BVAS 0分的疾病缓解期的患者(58例)，另一组包括新发病的BVAS打分显著大于0分的疾病活动的患者(45例)。这与Kain等[5，27，29]研究中所有患者均为新发病或复发，且BVAS打分均在10～15分有显著不同。在UNC患者血浆中仅15例新发患者，其阳性率为47%，仍较Roth等[5，27，29]报道低很多，但高于健康对照组。所有BVAS 15分患者的血清应用Western Blot和IIF检测均为阴性，同时阳性对照组检测结果仍为阴性，说明检测的不是抗hLAMP-2抗体，这些进一步证实检测方法的不一致造成结果的不一致。

通过比较发现不仅在病例入组还是检测方法的选择上，Kain等[5，27，29]和Roth等[28]均不同，这种病例及方法上的差异最终导致研究结果的不一致。

抗LAMP-2抗体与AAV致病机制

抗LAMP-2抗体在AAV中的致病机制目前研究较少，已知中性粒细胞在非特异性免疫系统中起十分重要的作用，在小血管炎肾脏损伤处大量浸润,且外周的中性粒细胞也增高。抗LAMP-2抗体能激活中性粒细胞及内皮细胞[5]，而中性粒细胞细胞外网络(NETs)是Brinkmann 研究小组新近发现的中性粒细胞另一种杀菌机制[33]，即从死亡的中性粒细胞释放出来的核酸物质和颗粒蛋白(弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和髓过氧化物酶等)组成的网状结构，可捕杀病原体。Kessenbrock 等[34]研究证实小血管炎患者在有炎症的肾脏中发现有NETs 沉积，循环血中也检出髓过氧化物酶和弹性蛋白酶与 NETs 中的DNA 形成的复合物。唐莎等[35]研应用抗 LAMP-2 抗体刺激中性粒细胞，发现LAMP-2抗体能促进NETs形成，且自身抗原 MPO、 PR3及LAMP-2包含在 NETs内，而抑制还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性可阻断NETs形成，说明LAMP-2抗体可能通过诱导中性粒细胞异常死亡，释放内源性危险信号，激活自身免疫反应等来维持血管炎的恶性持续状态。而抗LAMP-2抗体体内外的是否有直接的致病作用，需要进一步研究阐明。

总 结

AAV肾损害是较常见的继发性肾脏疾病，预后较差，病情容易反复，发病机制目前并不明确，近年来抗LAMP-2抗体在AAV中发现是研究的重大进展之一，特别是LAMP-2的表位与某些细菌的FimH具有同源性，在动物试验中产生分子模拟效应，进一步导致肾损害及寡免疫性新月体肾炎。虽无人体内致病的直接证据，但ANCA患者中发病期有较高的含有FimH细菌阳性率，佐证了含有FimH细菌的致病性，为揭示细菌导致AAV的发病机制提供线索，但这需要大规模的临床试验证实。

ANCA对AAV的诊断价值目前被公认，但在ANCA阴性血管炎诊断中抗LAMP-2抗体诊断价值需要进一步验证。其意义还在用免疫抑制治疗后缓解患者的抗hLAMP-2抗体消失的速度比抗MPO和PR3快，病情复发前浓度会增高，是否抗hLAMP-2抗体比现有的方法能够更真实的反应疾病的活动度，如果是这样的话，抗hLAMP-2抗体的检测将极大地提高免疫抑制剂的个体化应用。最近研究表明在过敏性紫癜[36]、皮肤结节性多动脉炎[37]及肺出血肾炎综合征患者中[38]患者血清中发现了抗hLAMP-2抗体，这些研究表明抗hLAMP-2抗体可能参与AAV以外的其他血管炎及新月体肾炎发病机制，需要进一步研究证实。虽然当前存在AAV患者血清中的抗hLAMP-2抗体绝对阳性率及其与疾病活动性的关系尚存在争议，多因检测方法及入选病例偏差造成的，通过检测方法的改进和设计良好的随机、对照、双盲研究，这些问题可能被解决。随着抗hLAMP-2抗体的深入研究，必将为AAV的发病机制认识、诊断特别是ANCA阴性患者的诊断、病情活动的判断及免疫抑制剂的个体化治疗产生积极的影响。

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