首次发现扶桑绵粉蚧体内存在沃尔巴克氏体

唐 远，王 超，陆永跃

(华南农业大学昆虫学系，广州 510642)

Wolbachia是一种立克次氏体细菌，有立克次体的一般特征，其家族中的成员属于Proteobacteria的α亚门，为革兰氏阴性细菌，广泛分布于节肢动物体内，已报道侵染了大约20%的昆虫种类(Werren， 1997;Harrietand Henk， 2003)。Wolbachia随母系遗传，能在昆虫的个体、群体间迅速进行横向传播，参与调控寄主的多种生殖活动，包括诱导生殖不亲和、孤雌生殖、雌性化、杀雄性及增强雄性或雌性的生殖力等，近年来Wolbachia的功能、作用规律和机制等成为了国际生物学研究的热点 (龚鹏等，2002;施婉君等，2002)。

目前确认昆虫体内是否感染Wolbachia的方法是主要是检测其细胞周期基因16S rDNA、23S rDNA、ftsZ和编码Wolbachia表面蛋白的wsp基因(surface protein of Wolbachia) (龚鹏和沈佐锐，2002)。Zhou等 (1998)在wsp序列分析的基础上，将沃尔巴克氏体细分为12个亚群(subgroup)，并设计了这12个亚群的wsp基因诊断的PCR扩增特异引物，建立了相对完善的沃尔巴克氏体wsp基因诊断技术。此后，在GenBank中登录并获得专利号的 wsp基因越来越丰富，为Wolbachia的研究提供了大量的资料。目前该技术已经广泛应用于昆虫 (龚鹏等，2002;孙晓等，2004)、蜘蛛 (杨启伟等，2008)、螨类 (苗慧等，2004;Gotoh et al.，2005)等体内Wolbachia的检测。

扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley属同翅目、粉蚧科，1898年在美国新墨西哥州首次发现并定名 (Tinsley，1898)。2005年该虫在印度和巴基斯坦棉花上暴发成灾，造成巨大经济损失，2006年两国的旁遮普邦棉花均减产12%，2007年减产达到 40% (Dutt，2007;Hodgson et al.，2008)。2008年8月在我国广州发现该虫危害 (武三安和张润志，2009;Lu et al.，2011)。由于它是棉花生产的潜在重要害虫，2010年5月我国将扶桑绵粉蚧增列为全国农业、林业植物检疫性有害生物 (王琳和杨晓朱，2010)。该虫寄主范围广，包括葫芦科、豆科、茄科、唇形科、锦葵科、藜科等100多种植物，其中棉花、烟草、南瓜、番茄等是重要的经济作物 (Tinsley，1898;陆永跃等，2008;孙峰和陆永跃，2011)。风险分析结果显示，该虫对我国各大棉区棉花生产均存在巨大威胁 (王艳平等，2009)。因此，掌握该虫生物学、生态学，研制有效的防治策略和技术十分必要。开展扶桑绵粉蚧体内共生菌Wolbachia研究，对了解该虫入侵种群生殖生物学变化、开发应用Wolbachia控制害虫的新途径等均具有重要意义。本文应用wsp基因诊断技术检测了入侵我国的扶桑绵粉蚧种群中沃尔巴克氏体存在情况，首次发现了Wolbachia感染现象。

1 材料与方法

1.1 扶桑绵粉蚧样品及其保存

供试的扶桑绵粉蚧于2011年11月采自海南省海口市，采回来的粉蚧在室内用扶桑进行连续饲养繁殖5代，获得的雌成虫以无水乙醇浸泡，保存于－40℃的低温冰柜备用。

1.2 总DNA的提取

总DNA的提取在参照温硕洋和何晓芳(2003)的方法并进行一些修改:取单头雌成虫放入1.5 mL的离心管，先加入6 μL的STE(100 mM NaCl;10 mM Tris － Cl，pH 8.0;1 mM EDTA，pH 8.0)，研磨匀浆，加入54 μL的STE来清洗研磨杵，再加入6 μL蛋白酶K(200 μg/mL)，研磨液在56℃恒温器中消化2 h，消化后的产物在95℃孕育45 s，14000 r/min离心1 min沉淀残渣，上清液作为做PCR的模板或保存在 －20℃冰箱中备用。

1.3 wsp基因扩增及电泳检测

wsp基因的PCR扩增方法参照Zhou等 (1998)。扩增引物为:wsp81F(5'TGGTCCAATAAGT GATGAAGAAAC)和wsp 691R(5'AAAAATTAAACGCTACTCCA)，由上海生工科技有限公司合成。

扩增体积为25 μL:含模板DNA(扶桑绵粉蚧总DNA)1 μL，20 μmol/L正向引物和反向引物各 1 μL，2.5 mM dNTP 混合液 2 μL，5 U/μL Taq酶 (TaKaRa)0.2 μL，10×buffer(含镁离子)2.5 μL，无菌双蒸水 17.3 μL。

扩增条件:94℃预变性 4 min;94℃ 45 s;54℃45 s;72℃ 1 min;扩增35个循环;最后72℃延伸10 min。扩增反应结束后，取PCR特异性扩增产物5 μL在2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测 (电压72 V，电泳缓冲液为1×TAE)，紫外灯下观察结果，以明确wsp基因的存在与否及扩增片段的大小。

1.4 wsp基因片段克隆及测序

用电泳凝胶回收试剂盒 (天根生化科技 (北京)有限公司生产)对目的片段进行分离纯化后，克隆到该公司的pGM－T载体中，筛选出阳性克隆，将转化菌株送至上海英骏生物技术有限公司进行测序，并在NCBI中进行序列比较。

2 结果与分析

特定基因区段的PCR特异性扩增已经成为鉴定昆虫体内细菌共生的常规途径。利用沃尔巴克氏体wsp基因的1对通用引物 (81F，691R)，成功地从扶桑绵粉蚧雌成虫的总DNA中扩增到一段550 bp左右的wsp基因片段 (图1)，并通过5次验证。经过测序分析，所得wsp基因序列实际长度为540 bp，具体序列见图 2。将所得序列与GenBank中注册的Wolbachia核苷酸序列进行同源性比较，同源性最高可达到99%，证明扶桑绵粉蚧雌成虫体内存在Wolbachia。

图1 扶桑绵粉蚧沃尔巴克氏体wsp基因PCR特异性扩增片段 (约550bp)Fig.1 Specific amplified fragment of Wolbachia wsp by PCR in the solenopsis mealybug

图2 扶桑绵粉蚧雌成虫体内沃尔巴克氏体wsp基因序列Fig.2 Wsp sequence of Wolbachia infecting the solenopsis mealybug female

3 结论与讨论

本文的研究为入侵我国的扶桑绵粉蚧感染Wolbachia提供了分子生物学依据，明确了Wolbachia对扶桑绵粉蚧的感染现象。通过对CABI、JCR、CNKI等文献数据库以及GenBank的检索，发现国内外对Wolbachia在粉蚧体内的共生现象鲜有报道，仅Paul(2006)在著作中提及来自巴西的粉蚧 Phenacoccus herreni体内检测到Wolbachia的存在。因此本文关于在扶桑绵粉蚧体内发现Wolbachia共生的现象在国内外尚属首次。

扶桑绵粉蚧是我国近年来的一种新外来入侵害虫，具有繁殖能力强，扩散迅速，危害严重的特点。兼营孤雌生殖、繁殖能力强成为其种群易扩散传播并成灾的有利因素之一 (Vennila et al.，2010)。由于不需与雄性个体交配，孤雌生殖个体更容易以少量种群进入新生境并建立种群。在新的寄主上不需要雄虫的存在也能大量产卵，孵化出新的后代，进行新一轮的生殖和传播。其特殊的繁殖方式和强繁殖能力加强了该虫传播和扩散的可能性和风险性。扶桑绵粉蚧的孤雌生殖可能与沃尔巴克氏体的共生有关，已证实沃尔巴克氏体参与至少40多个物种的孤雌生殖 (Stouthamer，1997)。未来的研究将进一步针对扶桑绵粉蚧的不同地理种群检测其是否感染沃尔巴克氏体，明确我国扶桑绵粉蚧感染Wolbachia的基本类群及在种群中的感染率，在此基础上进一步进行抗生素处理试验，以探究扶桑绵粉蚧的生殖方式与Wolbachia相关性，分析Wolbachia对我国扶桑绵粉蚧生殖活动的具体作用。

References)

Dutt U，2007.Mealy bug infestation in Punjab:Bt.Cotton falls flat.Online article at http:∥www.countercurrents.org/dutt210807.htm.7 July 2007.

Gong P， Shen ZR， 2002. Molecular diagnostic techniques of Wolbachia.Hereditas，24(2):207－210.［龚鹏，沈佐锐，2002.PCR为基础的分子技术检测沃尔巴克氏体的研究进展.遗传，24(2):207－210］

Gong P，Shen ZR，Li ZH，2002.PCR －based detection of Wolbachia infected in naturalpopulationsofwheataphids in China.Entomological Knowledge，39(3):188－191.［龚鹏，沈佐锐，李志红，2002.我国麦蚜体内沃尔巴克氏体 (Wolbachia)的检测.昆虫知识，39(3):188－191］

Gong P，Shen ZR，Li ZH，2002.Wolbachia endosymbionts and their manipulation of reproduction of arthropod hosts.Acta Entomol.Sinica，45(2):241－252.［龚鹏，沈佐锐，李志红，2002.Wolbachia属共生细菌及其对节肢动物生殖活动的调控作用.昆虫学报，45(2):241－252］

Gotoh T，Noda H，Fujita T，Iwadate K，Higo Y，Saito S，Ohtsuka S，2005.Wolbachia and nuclear－nuclear interactions contribute to reproductive incompatibility in the spider mite Panonychus mori(Acari:Tetranychidae).Heredity，94:237－246.

Harriet LH，Henk RB，2003. Sperm chromatin remodelling and Wolbachia － induced cytoplasmic incompatibility in Drosophila.Biochem.Cell Biol.，81(3):229－240.

Hodgson C，Abbas G，Jalal AM，2008.Phenacoccus solenopsis Tinsley(Sternorrhyncha:Coccoidea:Pseudococcidae)，an invasive mealybug damaging cotton in Pakistan and India，with a discussion on seasonal morphological variation.Zootaxa，1913:1－35.

Lu YY，Guan X，Zeng L，2011.Effect of temperature on the developmentofthe mealybug，PhenacoccussolenopsisTinsley(Hemiptera:Pseudococcidae). Sci. Res. Essays， 2011， 6(31):6459－6464.

Lu YY，Zeng L，Wang L，Xu YJ，Chen KW，2008.Precaution of solenopsis mealybug Phenacoccus solenopsis Tinsley.J.Environ.Entomol.，30(4):386－387.［陆永跃，曾玲，王琳，许益镌，陈科伟，2008.警惕一种危险性绵粉蚧入侵中国.环境昆虫学报，30(4):386－387］

Miao H，Hong XY，Xie L，Xue XF，2004.Sequencing and sequence analysis of the wsp gene of Wolbachia in Tetranychus cinnabarinus(Acari:Tetranychidae).Acta Entomol.Sinica，47(6):738 －743.［苗慧，洪晓月，谢霖，薛晓峰，2004.朱砂叶螨体内感染的Wolbachia的wsp基因序列测定与分析.昆虫学报，47(6):738 －743］

Paul AC，Bruno LR，2006.Cassava － Mealybug interactions.IRD Editions，21 －22

Shi WJ，Cheng JA，Zhu ZR，Jiang MX，Lou YG，2002.Progress in the studies of insect symbiont Wolbachia.Acta Ecol.Sinica，22(3):409－419.［施婉君，程家安，祝增荣，蒋明星，娄永根，2002.昆虫共生细菌Wolbachia的研究进展.生态学报，22(3):409－419］

Stouthamer R，1997.Wolbachia － induced Parthenogenesis.New York:Oxford University Press，102 －124.

Sun F，Lu YY.，2011.A new invasive mealybug，Phenacoccus solenopsis，could cause serious damage to cotton plants.Chin.Cotton，2011，38(2):19－20.［孙峰，陆永跃，2011.新入侵害虫扶桑绵粉蚧严重危害棉花.中国棉花，38(2):19－20］

Sun X，Li ZH，Liang GQ，Chen HJ，Chen NZ，2004.Detection of wolbachia in Bactrocera(B.)dorsalis(Hendel)of China.Plant Quarantine，18(6):321－313.［孙晓，李志红，梁广勤，陈洪俊，陈乃中，2004.首次发现我国柑橘小实蝇沃尔巴克氏体的共生.植物检疫，18(6):321－313］

Tinsley JD，1898.Notes on Coccidae，with descriptions of new species.Can.Entomol.，30:317－320.

Vennila S，Deshukh AJ，Pinjarkar D，Agarwal M，Ramamurthy W，Joshi S，Kranthi KR，Bambawale OM，2010.Biology of the mealybug，Phenacoccus solenopsis on cotton in the laboratory.J.Insect Sci.，10(115):1－9.10:115

Wang L，Yang XZ，2010.The biological character，damage and managementof solenopsis mealybug，Phenacoccus solenopsisTinsley.J.of Environ.Entomol.，32(4):561－564. ［王琳，杨晓朱，2010.入侵害虫扶桑绵粉蚧生物学、危害及防治技术.环境昆虫学报，32(4):561－564］

Wang YP，Wu SA，Zhang RZ，2009.Pest risk analysis of a new invasive pest， Phenacoccussolenopsis， to China. Chin. B.Entomol.，46(1):101－106. ［王艳平，武三安，张润志，2009.入侵害虫扶桑绵粉蚧在中国的风险分析.昆虫知识，46(1):101 －106］

Wen SY，He XF，2003.A method of rapid preparation of trace－DNA templates of insects for PCR.Entomological Knowledge，40(3):276－279.［温硕洋，何晓芳，2003.一种适用于昆虫痕量DNA模板制备的方法.昆虫知识，40(3):276－279］

Werren JH，1997.Biology of Wolbachia.Ann.Rev.Entomol.，42:587－609.

Wu SA，Zhang RZ，2009.A new invasive pest，Phenacoccus solenopsis，threatening seriously to cotton production.Chin.B.Entomol.，46(1):159－162.［武三安，张润志，2009.威胁棉花生产的外来入侵新害虫一扶桑绵粉蚧.昆虫知识，46(1):l59－162］

Yang QW，Yun YL，Peng Y，Liu FX，Chen J，2008.Rapid detection of spider of Wolbachia.Acta Arach.Sinica，17(2):121 －123.［杨启伟，云月利，彭宇，刘凤想，陈建，2008.蜘蛛体内Wolbachia的快速检测.蛛形学报，17(2):121－123］

Zhou WG，Rousset F，O＇Neill S，1998.Phylogeny and PCR － based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.Roy.Soc.，265:509－515.