烟草PVYN辽宁分离物全序列测定与分析

王芳 ，高正良，周本国，许大凤，安梦楠，吴元华

1沈阳农业大学，植物保护学院，沈阳市东陵路120号 110161；

2安徽省农业科学院，烟草所，合肥市农科南路40号 230031

测定马铃薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）基因组全序列是了解PVY生物学功能的重要基础，对于研究该病毒的蛋白功能、致病性及对烟草生产均具有重要意义。陈炯等对已知全序列的马铃薯Y病毒编码的多聚蛋白氨基酸序列作多重序列分析后，设计并筛选出特异性PCR简并引物，初步建立了基因组全序列的PCR和RACE技术快速扩增方法，并成功应用该方法扩增了5个基因组全序列未知的马铃薯Y病毒属病毒的基因组全序列[1]。国外已报道了PVY不同株系的全序列[2]。国内对一些中国分离物的分子特性也进行了研究，测定了分离物Guiding-3、HC-2 quan、WA-13 quan等分离物的全序列（GenBank登录号：HM590405、HM590406、 HM59040711。但关于烟草上目前国际上没有统一的PVY病毒株系的划分方法，常用的是鉴别寄主症状反应和序列分析，或者两者结合的方法来划分和鉴定PVY株系。随着种植品种、种植条件、气候条件的改变，病毒株系易出现变异和重组现象，报道的病毒重组株系有PVYNTN、PVYNW（在北美被称为PVYN:O）、PVYNNP株系[3-4]。本文对PVY辽宁分离物PVY-LN进行了全序列测定，并对所得的序列推导出的多聚蛋白氨基酸序列做系统进化树以鉴定病毒株系，同时采用RDP序列重组分析软件包对所得序列进行了重组分析，报道如下。

1 材料与方法

1.1 毒源

从烟草脉坏死病烟株上分离纯化的马铃薯Y病毒脉坏死株系辽宁分离物（Potato virus Y— vein necrosis strain Liaoning isolate, PVYN-LN）繁殖保存在普通烟NC89上。

1.2 方法

1.2.1 引物

利用Sequencher 5.0 软件对GenBank中已有的PVY全序列进行序列比对，选择病毒序列最为保守的区域利用Oligo 6.0软件进行引物设计（表1），引物由宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）合成。

表1 PVY全长扩增特异性引物

1.2.2 植物RNA提取

使用TaKaRa RNAiso Plus提取植物的Total RNA，对提取的RNA进行DNase I处理，使用DNase I（RNase Free）（TaKaRa），操作完全按照说明书进行。

1.2.3 反转录

使用TaKaRa High Fidelity PrimeScriptTM RT-PCR Kit进行反转录实验，同时设立M-MLV（-）对照。操作按照说明书进行。cDNA产物于-20℃保存备用。

1.2.4 PCR扩增

使用TaKaRa PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase，取2 μL以上步反转录得到的cDNA，10 μL 5 ×PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+Plus)，4 μL dNTP Mixture (各 2.5 mmol/L)，1 μL PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μL)，1 μL 引 物 F830/ R2678、F5711/ R7713、F7442/ R8940、PVY1F/ PVY3R，31 μL dH2O，总体系50 μL。然后进行以下反应：98℃，10 s；50℃，15 s；68℃，10 min，35个循环。PCR产物取5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳。

以PVY1F/ PVY3R PCR产物为模板， PVY1F/R2743、F1810/ R5868、F5711/ PVY3R分别为引物进行2nd PCR扩增；反应体系及条件同上，PCR产物取5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.5 3’RACE

使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0合成cDNA，同时设立M-MLV（-）对照（即不加反转录酶）。操作参照说明书。

以上步反转录得到的cDNA为模板，使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0和TaKaRa LA Taq ® with GC Buffer，进行PCR扩增，取2 μL反转录反应液，8 μL 1× cDNA Dilution Buffer II，1 μL F1 Primer（20 μmol/L），2μL 3′ RACE Outer Primer（10 μmol/L），25 μL 2×GC Buffer I，0.5μL TaKaRa LA Taq（5 U/μL），11.5 μL dH2O， 总 体系50 μL。进行如下反应：94℃，3 min；94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，2 min，30个循环。取 5 μL 进行3% 琼脂糖凝胶电泳。

1.2.6 5’RACE

使用TaKaRa 5′-Full RACE Kit对总 RNA进行“去帽子”反应，并与5′RACE Adaptor连接后，反转录合成cDNA，同时设立M-MLV（-）对照。操作参照说明书。

使用TaKaRa LA Taq，进行1st PCR扩增。取2 μL上述反转录得到的cDNA为模板，8 μL 1×cDNA Dilution Buffer II ，1 μL R1 Primer（20μmol/L），2 μL 5 ′ RACE Outer Primer（10 μmol/L），25 μL 2×GC Buffer I ，0.5 μL TaKaRa LA Taq（5 U/μL），11.5 μL dH2O ，总体系 50 μL 。于 94℃，3 min；94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，2 min，30个循环。以上述1st PCR产物为模板，R2为Inner PCR引物进行2nd PCR扩增。取1 μL 1st PCR反应液，8 μL dNTP（2.5 mmol/L each），1 μL CTE867-R2 Primer（20 μmol/L），2 μL 5 ′ RACE Inner Primer（10 μmol/L），25 μL 2×GC Buffer I ，0.5 μL TaKaRa LA Taq（5 U/μL），11.5 μL dH2O ，总体系 50 μL 。于 94℃，3 min；94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，2 min，30 个循环。取5 μL进行3 %琼脂糖凝胶电泳。

1.2.7 PCR产物纯化与测序

使用TaKaRa Agarose Gel DNA Puri fi cation Kit Ver.2.0切胶回收上述PCR产物，进行测序。

2 结果

2.1 PVY PCR扩增

以引物 F830/ R2678、F5711/ R7713、F7442/ R8940、PVY1F/ PVY3R扩增的PCR产物进行1%琼脂糖电泳结果如下：

图1 一步PCR电泳图谱

以 PVY1F/ PVY3R PCR产物为模板， PVY1F/R2743、F1810/ R5868、F5711/ PVY3R 分别为引物进行2nd PCR扩增；反应体系及条件同上，PCR产物取5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如下:

图2 二步PCR电泳图谱

2.2 产物纯化与测序

使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0切胶回收上述PCR产物的主带，测序得到病毒序列9079 bp。

2.3 3’RACE

以病毒Total RNA为模板，已获得的约9K的序列为依据，对病毒进行3′RACE扩增。分析3′RACE PCR产物测序结果, 3′RACE已经得到poly(A)尾，获取未知序列约594 bp。对扩增产物进行3% 琼脂糖凝胶电泳，结果如下:

图3 3’RACE一步PCR电泳图谱

2.4 5’RACE

以病毒Total RNA为模板，以获得的约9K的序列为依据，对病毒进行5′RACE扩增。分析5′RACE测序结果, 5′RACE已经获取未知序列约29 bp。对扩增产物进行3% 琼脂糖凝胶电泳，结果如下:

图4 5’RACE一步和二步PCR电泳图谱

2.5 序列测定与分析

对PVYN-LN分离物的PCR相应产物进行回收，然后直接进行序列测定。利用Sequencher 5.0软件对所测的序列进行分析，结果表明，PVYN-LN分离物全基因组序列（NCBI登录号为JQ971975）共由9714个碱基组成（含Poly A尾），整条序列仅包含一个由9186个碱基组成的开放读码框（ORF），可编码一条包含3061个氨基酸的多聚蛋白。

对PVYN-LN全序列进行BLAST比对，PVYN-LN与PVY不同株系代表性序列构建系统发育树分析（图5）表明，该病毒与在 GenBank 中登录PVY病毒存在一定相似性，PVYN-LN与其他PVY病毒氨基酸序列构建进化树，分析结果显示，PVYN-LN与DQ157180氨基酸亲缘关系最近，并与HQ912867、AJ585198、AJ585197、X97895形成一个分枝，氨基酸分析说明PVYN-LN属于已报道的PVYN株系。

利用RDP4序列重组分析软件包对PVYN-LN进行重组分析，发现所获全长序列内存在1个潜在的重组区域，重组区域用3种以上方法检测(p值选择0.05)，但检测到的重组差异不显著GENECONV[5](p值 =3.094×10-1)、BOOTSCAN[6](p 值 =1.208×10-2)、MAXCHI[7]（未检测出）、CHIMAERA[8]（未检测出）和SISCAN[9]（未检测出）。因此，可以认定PVYN-LN基因组序列无重组。

图5 PVY-LN与世界不同的25个分离物系统进化分析（登录号|病毒名称|株系|国家）

3 结果与讨论

目前，马铃薯Y病毒（PVY）已成为我国侵染烟草的主要病毒。张帅等以GenBank已报道的PVY全序列为基础设计了3对特异性引物，扩增得到了Guiding-3基因组全序列，并分析得出Guiding-3与PVYN株系有较高的亲缘进化关系[10]。王彪等利用RT-PCR和5’RACE等技术克隆并测定了AQ4和FZ10两个PVY分离物的基因组全序列，分析得出AQ4和FZ10均为N和O株系分离物的重组体[11]。陈士华等分别克隆了黑龙江、山西、贵州等3省的3个PVY的p1基因和CP基因，通过系统的序列分析对各分离物的株系种类进行了鉴定。认为各产区株系分化现象明显，其中黑龙江分离物为PVYNTN株系，贵州分离物和山西分离物为PVYN:O株系[12]。

本研究对PVYN-LN辽宁分离物进行了全基因组测序，通过基因组序列分析发现该病毒与DQ157180同源性最高，二者氨基酸序列一致率为 99%。系统进化树分析表明该病毒属于已报道的PVYN株系。利用RDP4序列重组分析软件包对PVYN-LN分析，认为PVYN-LN未重组。基因组全序列的获得为进一步研究病毒的致病性奠定了基础。

[1]陈炯,陈剑平.Potyvirus属成员基因组全序列的简并引物PCR和RACE扩增方法[J].病毒学报,2002,18(4):371-374.

[2]Lorenzen J，Nolte P，Martin D，et al.NE-11 represents a new strain variant class of Potato virus Y[J].Arch Viro,2008, 153:517-525.

[3]Glais L，Tribodet M，Kerlan C.Genomic variability in Potato potyvirus Y(PVY):evidence that PVYNW and PVYNTN variants are single or mμltiple recombinants between PVYO and PVYN isolates[J].Arch Viro, 2002,147:363-378.

[4]Nie X，Singh R P.Speci fi c differentiation of recombinant PVYN:O and PVYNTN isolates by multiplex RT-PCR[J].J Virol Methods,2003,113:69-77.

[5]Sawyer S A.GENECONV: A computer package for the statistical detection of gene conversion [OL].Distributed by the author.Department of Mathematics, Washington University in St.Louis, 1999.http://www.math.wustl.edu/～sawyer.

[6]Salminen M O, Carr J K, Burke D S, et al.Identification of breakpoints in intergenotypic recombinants of HIV type 1 by Bootscanning [J].AIDS Research and Human Retroviruse1995,11:1423-1425.

[7]Maynard Smith J.Analyzing the mosaic structure of genes[J].Journal of Molecular Evolution, 1992,34:126-129.

[8]Posada D, Crandall K A.Evaluation of methods for detecting recombination from DNA sequences: computer simulations [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001,98:13757-13762.

[9]Gibbs M J, Armstrong J S, Gibbs A J.Sister scanning:a Monte Carlo procedure for assessing signals in recombinant sequences [J].Bioinformatics (Oxford,England),2000,16:573-582.http://www.anu.edu.au/BoZo/software/.doi:10.1093/bioinformatics/16.7.573.

[10]张帅，杨金广，王凤龙，等.贵州烟草上一株PVY坏死株系全序列测定与分析[J].中国烟草科学，2011,32（1）：47-51.

[11]王彪，两个马铃薯Y病毒分离物的生物学和分子特性[D].山东农业大学，2009.

[12]陈士华，刘晓磊，张晓婷，等.中国部分马铃薯产区马铃薯Y病毒（PVY）的株系分化与鉴定[J].河南农业大学学报，2011,45(5)548-551.