番茄红素在鱼藤酮诱导的PC12 细胞凋亡中的作用

罗连响，李晓玲，鲍 波，3

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一种中枢神经系统退行性疾病，可能是由线粒体功能障碍、氧化应激、细胞凋亡和泛素-蛋白酶体功能失调等多种机制引起的［1］。番茄红素是一种天然色素，广泛存在于番茄、胡萝卜、西瓜、番石榴等蔬菜和水果中，其化学结构式中含有11 个共轭双键及2 个非共轭双键，这种多不饱和脂肪烃结构使得该化合物具有超强的抗氧化活性。研究发现番茄红素具有抗肿瘤［2］、抗炎症和抗心血管［3］疾病等多方面的生物学活性。另外，番茄红素可以被人体吸收，通过“血脑屏障”进入中枢神经系统发挥神经元的保护作用，因此，番茄红素对神经退行性疾病的作用逐渐受到关注。为了进一步探讨番茄红素的神经保护作用，本研究采用线粒体呼吸链抑制剂鱼藤酮诱导大鼠PC12 细胞凋亡模型，观察番茄红素对神经元凋亡的抑制作用，以及番茄红素对细胞凋亡抑制的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 PC12 细胞由中山大学病理教研室惠赠。细胞培养于含有10%小牛血清的RMPI1640 培养基，在37℃、5% CO2培养箱内培养。

1.1.2 仪器 流式细胞仪(美国BD 公司)，全自动酶标仪(美国伯乐公司)，荧光显微镜(日本尼康公司)。

1.1.3 药品与试剂 番茄红素、鱼藤酮、Hoechst33258 染料、罗丹明123 购自美国Sigma 公司，CCK-8 检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，Annexin V/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自北京博奥森生物科技有限公司，其它均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及药物处理细胞 细胞接种于96 孔板或6 孔板中，24h 贴壁后，加入不同浓度的番茄红素，使终浓度分别达到3、10、30μmol/L，2h后根据分组加入鱼藤酮，使终浓度达到0.5μmol/L，实验分5 组:正常对照组、0.5μmol/L 鱼藤酮损伤组、3、10、30μmol/L 番茄红素预理组。

1.2.2 CCK-8 检测细胞存活率 细胞以105个/ml－1接种于96 孔板，每孔100μl，每组6 个复孔，按上述方法处理后，细胞培养结束后，每孔加入10μl CCK-8，继续孵育2h，酶标仪450nm 测定各孔OD 值。细胞存活率(%)=(实验组OD－空白组OD)/(对照组OD－空白组OD)×100%。

1.2.3 PC12 细胞凋亡形态学的观察 将PC12 细胞接种于六孔板内的盖玻片，待细胞贴壁生长后，各实验组按上述方法处理24h 后，弃上清，PBS 洗3 次，加入新鲜配置的4%多聚甲醛4℃固定20min，PBS 洗3 次，加终浓度为10μg/ml 的Hoechst33258 染液室温避光染色30min，PBS 洗3 次，用封片液封片后荧光显微镜下观察并摄片。

1.2.4 annexin V/PI 流式细胞分析法检测细胞凋亡 将细胞按106/ml 接种六孔板，待细胞贴壁后按上述方法处理24h 后，弃培养基，用不含EDTA的胰酶消化后离心收集细胞，用PBS 洗2 次，用400μl 的annexin V 结合液悬浮细胞，然后向其中加入5μl 的annexin V-FITC 染色液，轻轻混匀后于4℃避光孵育15min，加入10μl PI 染色液后轻轻混匀于4℃避光孵育5min，立即用流式细胞仪检测。

1.2.5 线粒体膜电位检测 细胞以106/ml 接种于6 孔板待细胞贴壁后，药物处理24h，胰酶消化收集细胞，PBS 洗两次，将细胞重悬于PBS 中，加罗丹明123 染液，终浓度为10μg/ml，37℃，避光孵育30min(每隔10min 振摇一次)，离心去掉未结合的罗丹明123 染液，PBS 洗2 次，然后PBS 重悬，用流式细胞仪检测其荧光强度，以处理组细胞的平均荧光强度与正常对照组细胞的平均荧光强度的比值作为相对跨膜电位。

1.2.6 统计学处理 所有数据应用GraphPad Prism 5.0 软件进行处理，实验结果以均数±标准差(±s)表示，数据采用单因素方差分析(ANOVA)各组间差异，t 检验分析两两间差异。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 番茄红素对鱼藤酮诱导的PC12 细胞存活率的影响 与正常对照组相比，0.5μmol/L 鱼藤酮作用细胞24h 后，细胞存活率明显下降(P＜0.05)。不同浓度的番茄红素预处理均能明显降低鱼藤酮对细胞的毒性作用(P＜0.05)，且具有浓度依赖性(见表1)。

2.2 细胞凋亡的形态学观察 经Hoechst33258染色，空白对照组可见细胞核出现弥漫、均匀的低强度荧光(见图1A);0.5μmol/L 鱼藤酮作用PC12 细胞后，出现大量的细胞核呈浓染致密的固缩形态或是颗粒状荧光的凋亡细胞，蓝光比较强，且不均匀(见图1B);3、10、30μmol/L 番茄红素预处理细胞后，呈固缩状态的细胞核数明显减少，大部分细胞染色质呈均匀的低密度蓝光(见图1C、D、E)，提示番茄红素可明显减轻鱼藤酮诱导PC12 细胞的凋亡作用。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 结果显示，正常对照组组仅有少量凋亡细胞，为3.56%±1.01%。鱼藤酮损伤组可见较多的凋亡细胞(23.63%±2.31%)，较空白对照组明显增多(P＜0.05)。3、10、30μmol/L 番茄红素预处理细胞后，细胞凋亡分别为18.60%±1.95%、15.90%±1.00%、12.9%±0.82%。较鱼藤酮组明显减少(P＜0.05)，且具有浓度依赖性(见图2)。

2.4 线粒体膜电位 鱼藤酮作用PC12 细胞24h 后，罗丹明123 染色后细胞平均荧光强度明显减弱，为对照组的(69.56%±0.59%)，表明细胞MMP显著下降;分别加入3、30、30μmol/L 番茄红素预处理后，平均荧光强度增强，分别达到对照组的82.49%±1.68%、87.83%±2.29%和92.25%±2.66%)，与鱼藤酮组相比均具有显著性差异(P＜0.05)，表明番茄红素可抑制鱼藤酮引起的细胞膜电位下降。

表1 番茄红素对鱼藤酮所致PC12 细胞存活率的影响(±s，n=4)

表1 番茄红素对鱼藤酮所致PC12 细胞存活率的影响(±s，n=4)

与正常对照组相比* P＜0.05;与鱼藤酮损伤组相比#P＜0.05

3 讨论

研究发现长期暴露在鱼藤酮环境下可以增加患帕金森病风险［4］，环境因素在PD 发病中的作用日益受到人们的重视。本实验选用鱼藤酮损伤PC12细胞作为PD 体外模型，研究番茄红素的神经保护作用及其可能的机制，结果表明鱼藤酮可引起PC12细胞活性降低，细胞核改变，发生凋亡的细胞增多，流式检测细胞凋亡百分率增加，细胞线粒体膜电位下降，证实鱼藤酮有致凋亡的神经毒性。

番茄红素有强抗氧化活性，不管是天然的还是合成的都具有很强的淬灭自由基能力，对体内的脂质过氧化和DNA 氧化损伤有防护作用，能保护神经细胞结构稳定性，阻止神经递质多巴胺及乙酰胆碱的减少，在神经退行性疾病中发挥重要的作用。流行病学研究结果显示［5］，长期摄入富含番茄红素的食品能够有效提高老年人的认知能力和记忆功能，预防多种慢性中枢神经系统疾病的发生或发展。Hsiao［6］等报道番茄红素可以保护大鼠大脑局部缺血造成的神经元凋亡并抑制小胶质细胞的炎症性反应;Kumar［7］等的研究也表明番茄红素可以抑制3-硝基丙酸诱导的亨廷顿舞蹈症样症状，其机制与维持线粒体正常功能相关，Mingyue Qu［8］等的研究同样表明番茄红素可以通过抑制了Aβ25-35所致神经元细胞活性氧的产生和线粒体膜电位去极化，从而达到对原代培养大鼠皮层神经元的保护作用。本研究的结果显示番茄红素预处理后细胞凋亡率明显减少，证实番茄红素对鱼藤酮诱导的PC12 细胞损伤有保护作用。

线粒体是细胞生命活动的控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，也是细胞凋亡的调控中心，线粒体是凋亡过程中一个重要的调控器［9］，多数凋亡发生过程都伴有线粒体膜电位的异常［10］。线粒体功能障碍可导致ATP 水平的降低、质子泵功能受损，进而导致线粒体膜电位的下降，从而启动细胞凋亡，线粒体功能障碍也被认为是细胞凋亡早期信号之一。我们通过实验发现番茄红素通过稳定线粒体膜电位和改善细胞能量供应从而抑制鱼藤酮导致的PC12 细胞损伤的膜电位下降和细胞凋亡的发生，这可能是番茄红素神经保护作用的机制之一。

图1 茄红素对0.5μmol/L 鱼藤酮诱导24h 的PC12 细胞凋亡形态的影响(×100)

图2 茄红素对鱼藤酮损伤PC12 细胞凋亡率的影响(±s，n=3)

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