胸腺切除对EAE 大鼠发病影响及机制的探讨

申张顺，高 倩，程树彬，辛立建，刘瑞春，郭 力，董 梅

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是以中枢神经系统炎性脱髓鞘为主要病理改变的自身免疫性疾病，发病机制尚不完全清楚。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)与人类MS 在临床表现、病理学特征及免疫学机制等多方面相似，是公认的研究MS 的动物模型。

CD4+CD25+Treg 细胞是新近发现的细胞亚群，具有抑制炎症反应、促进疾病缓解等重要作用，在多种自身免疫性疾病中发挥保护作用，同样可抑制EAE 病情进展，促进疾病恢复［1］。

研究表明，CD4+CD25+Treg 细胞来自于胸腺，在胸腺中发育、分化、成熟并输出到外周免疫环境，发挥其免疫调节作用。一般认为，到青春期后，胸腺随年龄的增长而逐渐萎缩退化，其功能亦随之衰退。新近研究表明:EAE 大鼠可见胸腺萎缩、凋亡加剧等病理学改变，胸腺在EAE 大鼠发病中可通过产生CD4+CD25+Treg 细胞，抑制EAE 进展［2］。关于成年期胸腺是否能分化调节T 细胞并进一步发挥抗炎、维持免疫耐受的调节作用的认识，目前仍相对空白。

本研究通过观察对比去胸腺和未去胸腺EAE大鼠发病过程，检测不同发病时期脊髓和脾脏Treg细胞的动态变化，明确胸腺是否在EAE 大鼠发病中具有免疫调节作用并进一步探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物、试剂器材

1.1.1 实验动物 健康雌性Wistar 大鼠(合格证编号:1006151)90 只，6～8 周龄，体重180～200g;雌性豚鼠3 只，体重350～400g，河北医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 试剂及仪器 卡介苗60mg/ml(北京生物制品研究所)，兔抗小鼠/大鼠Foxp3 抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，antirat CD4+(FITC)、anti-rat CD25+(PE)，anti-rat Foxp3(PE-CY5)及固定破膜剂(美国eBioscience 公司)，流式细胞仪(美国Beckman Coulter Etics XL)，离心机(TD5G，湖南凯达科学仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 去胸腺大鼠模型的制备［3］Wistar 大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定四肢及头部，沿前颈部及胸部中线剪开皮肤及皮下组织并暴露气管，沿气管前间隙于胸骨柄中点剪开胸骨约1.5 cm，显露胸腺上极。用显微镊轻轻牵引并分离胸腺两叶，当分离到下极时即与胸腔相通，此时迅速游离取下胸腺关闭胸腔，继而用10ml 注射器刺入大鼠右侧胸腔，缓缓回抽，一般可抽出胸腔内积气3～5ml，缝合皮下组织及皮肤。同样方法切开胸骨，保留胸腺，制备对照组假手术模型。

1.2.2 EAE 动物模型的制备［4］及分组 对去胸腺组大鼠和部分假手术组大鼠，以豚鼠全脊髓匀浆(GPSCH)为抗原进行免疫，建立Wistar 大鼠EAE动物模型。实验分为对照组(假手术大鼠未进行免疫)、去胸腺EAE 组和EAE 组(假手术大鼠进行免疫)，每组30 只，各组按发病时间及发病程度分为发病前期(免疫12d)、发病高峰期(发病后3d)和恢复期(发病后7d)，每组10 只。

1.2.3 指标观察 免疫当天为第0 天，观察大鼠精神、饮食、体重、二便及肢体活动，参照通用的评分标准进行神经功能评分:0 分:不发病;1 分:动物尾部无力;2 分:后肢轻度瘫痪+步态不稳;3 分:中度瘫痪但自主运动保存;4 分:肢体严重瘫痪，自主运动不能;5 分:濒死状态。

1.2.4 标本处理 按实验设计，以10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速取脾脏，进行流式细胞术检测，取脊髓腰膨大组织固定于4%多聚甲醛中，行HE 及免疫组化染色，观察炎症改变和脊髓组织中Foxp3的表达。将脾脏研磨、200 目细胞筛过滤制成细胞悬液，定量，加入抗CD4+、CD25+荧光抗体避光孵育30min，加入破膜剂破膜，加入Foxp3 抗体避光孵育30min 后，重悬细胞，上流式细胞仪检测Treg 细胞含量。

1.2.5 统计分析 所得数据采用SPSS13.0 统计软件进行统计分析，各组发病率用百分数表示，组间比较采用卡方检验，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组计量资料均数的比较应用ANOVA方差分析，组间两两比较采用LSD 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物发病情况的观察 两组动物均出现食欲不振、皮毛不光滑、体重下降等情况。继而出现尾部无力下垂、肢体瘫痪，多数动物为2 个以上肢体瘫痪，严重者出现濒死状态。EAE 组大鼠病情达高峰后，症状逐渐缓解，极少动物遗留后遗症状，去胸腺组大鼠发病率高于EAE 组(P＜0.05)，且瘫痪程度更重，症状持续，不能随病程缓解，神经功能评分显著高于EAE 组(P＜0.05)(见表1)。

2.2 组织病理学改变 对照组各时期脊髓组织内均未见炎性细胞浸润。去胸腺组和EAE 组在发病前期均可见少量散在炎性细胞浸润，对比无明显差异。去胸腺组发病第3 天和第7 天均可见大量炎性细胞浸润和多处“血管袖套”现象，均较EAE组程度严重，EAE 组发病第7 天较第3 天炎性细胞明显较少，“血管袖套”基本消失(见图1)。

2.3 脊髓Foxp3 表达 对照组不同时期脊髓组织Foxp3 少量表达(P＞0.05)。去胸腺组和EAE组Foxp3 阳性细胞数目随疾病进展均增高(P＜0.05)，不同时期EAE 组表达量均高于同时期去胸腺组(P＜0.05)，且两组表达量均高于对照组(P＜0.05)(见表2)。

2.4 脾脏CD4+CD25+Foxp3+T 的细胞含量对照组不同时期脾脏组织Foxp3 细胞含量无差异(P＞0.05)。去胸腺组EAE 组Foxp3 细胞含量随病情发展均增高(P＜0.05)，不同时期EAE 组的Foxp3 含量均高于同时期的去胸腺组(P＜0.05)，且两组Foxp3 的细胞含量均高于对照组(P＜0.05)(见表3)。

表1 各组发病率和神经功能评分比较(±s)

表1 各组发病率和神经功能评分比较(±s)

胸腺切除组与EAE 组比较* P＜0.05;7d 组与3d 组比较#P＜0.05

表2 不同组脊髓Foxp3 细胞阳性表达比较(±s)

表2 不同组脊髓Foxp3 细胞阳性表达比较(±s)

与对照组比较* P＜0.05;3d 组与发病前组比较#P＜0.05;胸腺切除组与EAE 组比较▽P＜0.05;7d 组与3d 组比较△P＜0.05

表3 不同组脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg 含量(%)比较

3 讨论

MS 的发病机制目前尚不完全明确，目前的资料多认为是由CD4+T 淋巴细胞介导的针对自身髓鞘抗原免疫应答及继发炎症级联反应损伤中枢神经白质所致。CD4+CD25+调节性T 细胞，即Treg 细胞在自身免疫应答的免疫负调节及自身免疫耐受中发挥着重要作用，可分为胸腺来源的自然调节T 细胞(nTR)和诱导性调节T 细胞(iTR)［5］。Foxp3 是叉头样转录因子家族成员之一，对CD4+CD25+T 细胞发育和功能起到很重要的调控作用［6］。Kim［7］等学者证实，Foxp3 高度选择表达于CD4+CD25+T 细胞，是CD4+CD25+T 细胞的重要标志，也是鉴定Treg 细胞的重要标志。CD4+CD25+T 细胞在维持外周免疫耐受、预防自身免疫性疾病的发生方面起着重要作用。研究发现，在MS 疾病活动期，CD4+CD25+T 细胞在患者外周血中的数量较非活动期明显减少，Foxp3mRNA 的表达量也显著降低［8］。雷帕霉素可通过增加EAE 大鼠外周淋巴器官脾脏中CD4+CD25+Foxp3 细胞含量，从临床和病理两方面明显减轻疾病的发生［9］。Th17 细胞是近年来研究发现的参与MS 发病的另一类T 淋巴细胞，通过分泌IL-17等细胞因子破坏血脑屏障，募集炎症细胞进入CNS，破坏髓鞘和轴索［10］。在EAE 发病中，Treg 细胞和Th17 细胞共同参与调节机体自身免疫过程，二者的平衡关系决定了疾病的发展方向，Th17 细胞功能亢进、Treg 细胞功能低下是导致MS 发病的关键所在［11，12］。CD4+CD25+T 细胞在抑制EAE 疾病的发展以及促进其恢复缓解方面发挥着至关重要的作用。

胸腺是机体最重要的中枢免疫器官，在维持机体正常免疫功能和免疫耐受机制中发挥着重要作用。胸腺在调节性CD4+CD25+T 细胞发育分化过程中占有十分重要的地位。实验发现，切除出生后3d 小鼠的胸腺可诱使其患多种自身免疫疾病如自身免疫性肠炎等［13］，在其体内检测不到CD4+CD25+Foxp3+T 细胞的存在，或含量极低，向其输注CD4+CD25+T 细胞则可防止自身免疫疾病的发生，表明CD4+CD25+T 细胞是在胸腺中发育分化，并输注到外周淋巴器官及组织，进而发挥其免疫调节作用。传统观念认为，在个体发育早期，CD4+CD25+T 细胞自胸腺输出到外周淋巴组织中后，即通过自身的扩增膨胀建立天然CD4+CD25+T 细胞群，而不再需要胸腺补充作用。到青春期以后，胸腺随年龄的增长而逐渐出现重量、形态以及功能的退化，T 细胞发育成熟过程受阻，生成数量减少，不再是机体的主要免疫器官，其免疫调节作用亦随之减弱。但Tsunoda［14］研究表明:大鼠发生EAE 后，可以见到胸腺出现萎缩、肿胀、凋亡加剧等病理学异常及生成的T 淋巴细胞功能受损等情况。在其胸腺中仍可以检测到大量CD4+CD25+T 细胞及Foxp3mRNA。因此，我们推断，在发生自身免疫疾病过程中，胸腺仍可输出Treg 细胞，抑制自身免疫损伤，发挥免疫调节作用。

本研究发现，去胸腺组大鼠发病率高、临床症状严重且不能缓解，炎症细胞浸润程度重，脊髓中Foxp3+阳性细胞数量及脾脏中CD4+CD25+Treg 细胞含量均较EAE 组明显下降，差异具有统计学意义。表明成年期胸腺确实在降低EAE 大鼠发病率、减轻神经功能损伤及促进病情缓解等方面发挥着极其重要的作用。EAE 组大鼠随疾病发生和进展，胸腺中CD4+CD25+Treg 细胞动员输出增加，在数量和功能上得到上调，通过其接触抑制和分泌抑炎细胞因子作用，抑制效应细胞功能，抑制炎症发展，疾病发展得到抑制并逐渐缓解。而去胸腺组大鼠在发病过程中，虽然其脊髓中Foxp3+阳性细胞数量及其脾脏中CD4+CD25+T 淋巴细胞含量有相对升高，但失去了胸腺的免疫调节作用。促炎因素一直处于主导地位，致使其发病症状重于EAE 组，而且丧失了疾病恢复缓解能力。

Van［15］等研究支持EAE 小鼠出现胸腺损伤及输出Treg 细胞减少，通过增加Treg 细胞可以改善EAE发病。因此，胸腺不仅是T 细胞发育器官，而且是重要的免疫调节器官，并参与免疫耐受形成。在EAE 大鼠发病过程中，胸腺能通过动员输出CD4+CD25+T 淋巴细胞到外周免疫环境和靶器官中，抑制炎症进展，促进疾病恢复，从而发挥其免疫调节作用。

图1 各组脊髓HE 染色比较(HE，200×)

［1］Stephens LA，Malpass KH，Anderton SM.Curing CNS autoimmune disease with myelin-reactive Foxp3+Treg［J］.Eur J Immunol，2009，39(4):1108－1117.

［2］Song F，Guan Z，Gienapp IE，et al.The thymus plays a role in oral tolerance in experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.J Immunol，2006，177(3):1500－1509.

［3］熊海波，夏穗生，温 浩.去胸腺大鼠模型的建立及改进［J］.中华器官移植杂志，2004，7:214－214.

［4］Dong M，Liu RC，Guo L，et al.Pathological findings in rats with experimental allergic encephalomyelitis［J］.APMIS，2008，116(11):972－984.

［5］Weiss JM，Bilate AM，Gobert M，et al.Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells，but not mucosa-generated induced Foxp3+T reg cells［J］.J Exp Med，2012，209(10):1723－1742.

［6］Chatila T.Molecular mechanisms of regulatory T cell development［J］.J Clin Immunol，2008，28(6):625－630.

［7］Kim JM，Rudensky A.The role of the transcription factor foxp3 in the development of regulatory T cells［J］.Immunol Rew，2006，212:86－98.

［8］翁益云，李旭华，夏君慧.多发性硬化患者外周血CD4+CD25+T细胞变化及其机制探讨［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2008，15(2):84－86.

［9］Donia M，Mangano K，Amoroso A，et al.Treatment with rapamycin ameliorates clinical and histological signs of protracted relapsing experimental allergic encephalomyelitis in Dark Agouti rats and induces expansion of peripheral CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells［J］.J Autoimmun，2009，33(2):135－140.

［10］Pierre Miossc.IL-17 and Th17 cells in human inflammatory diseases［J］.Microbes and infection，2009，11(5):625－630.

［11］张蓝方.Th17/Treg 平衡调节与疾病的关系进展［J］.J Jining Med Univ，2011，34(1):68－71.

［12］Luz-Crawford P，Kurte M，Bravo-Alegria J，et al.Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells［J］.Stem Cell Res Ther，2013，4(3):65.

［13］Asano M，Toda M，Sakaguchi N，et al.Autoimmune diseaseas a consequence of developmental abnormality of a T cell subpopulation［J］.J Exp Med，1996，184(2):387－396.

［14］Tsunoda I，Libbey JE，Kuang LQ，et al.Massive apoptosis in lymphoid organs in animal models for primary and secondary progressive multiple sclerosis［J］.Am J Pathol，2005，167(6):1631－1646.

［15］Tan YV，Abad C，Wang Y，et al.Pituitary adenylate cyclase activating peptide deficient mice exhibit impaired thymic and extrathymic regulatory T cell proliferation during EAE［J］.PLoS One，2013，8(4):61200.