缪刺对脑缺血大鼠细胞凋亡相关蛋白表达影响的研究

李雪青，石志敏（．河北联合大学中医学院，河北唐山063000；．唐山市中医医院，河北唐山063000）

·实验研究·

缪刺对脑缺血大鼠细胞凋亡相关蛋白表达影响的研究

李雪青1，石志敏2
（1．河北联合大学中医学院，河北唐山063000；2．唐山市中医医院，河北唐山063000）

目的：探讨缪刺对局灶性脑缺血大鼠神经保护作用的机制。方法：观察以免疫组化法检测缪刺对脑缺血模型大鼠脑缺血后24、48、72h 3个时间点大脑皮质细胞凋亡相关蛋白表达的影响。结果：缪刺对脑缺血模型大鼠大脑皮质C.53蛋白表达有抑制作用，对HSP70、PKB蛋白表达有促进作用。结论：缪刺对大鼠局灶性脑缺血具有保护作用，可能与细胞凋亡相关蛋白的表达有关。

缪刺；脑缺血；细胞凋亡；神经保护；大鼠

本研究通过观察缪刺对细胞凋亡相关蛋白的影响，进一步阐明缪刺对脑缺血的神经保护作用，同时也为缪刺的临床应用提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组 雄性Wistar大鼠80只，随机分成模型对照组、普通针刺组、缪刺组、普通针刺和缪刺同时组，每组20只大鼠。

1.2 针刺选穴与操作 模型对照组：不予治疗，每天同样抓取1次，不做其他处理。普通针刺组：根据华兴邦等研制的大鼠穴位图谱选取穴位：合谷、内关、委中、三阴交。针具：30号1寸毫针（华佗牌，苏州针灸器械厂）。操作方法：先在施针处常规消毒，然后持针依次在大鼠左侧肢体上（患侧）针刺以上4穴，为保证刺激强度的稳定，采用电针方法，直刺进针5mm，针柄连接于电针治疗仪电极上，频率2Hz，电压一般3.5V，电流1～2mA，疏密波，1次/d，30min/次。缪刺组操作同上，选穴在大鼠右侧肢体（健侧）。普通针刺和缪刺同时组：操作同上，双侧肢体同时选穴（健侧、患侧同时）。首次针刺造模术后6h开始，治疗各组疗程分别为1、3、5、10、15d，每日1次。

1.3 右侧大脑中动脉阻塞模型制作 采用改良的Longa和Nagasawa方法［1］：将Wistar大鼠制备为MCAO模型，操作方法：1）单股尼龙线，直径为0.231mm，长1.97cm，制成线栓，消毒后备用。2）用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。3）颈部切口，逐层分离并暴露右侧颈总动脉，小心分离颈外动脉。4）在已分离的CCA上结扎其近心端，远心端阻断血流、合线。5）剪一“V”形切口。6）将线栓球面端插入CCA上的切口，将线栓经CCA插入IcA内，向前徐进，向上插至McA起始部，此时自ECA、ICA分叉处计起，线栓推进长度约为（17.9±l）mm，造成MCA血供阻断。各组选取MCAO术后评分合格大鼠8只，进行实验操作。

1.4 缪刺对MCAO模型大鼠脑组织HSp70、PKB蛋白表达的影响 操作：1）载玻片防脱片剂处理。2）脑组织固定、脱水、透明、包埋及切片。3）将切片置于经防脱片剂处理过的载玻片上，保存，备用。4）石蜡切片脱蜡水化→显色剂DAB显色→显微镜观察。5）终止反应→复染→冲洗返蓝→脱水→封片观察。6）结果：胞核或胞浆棕黄色为阳性细胞。7）图像分析：400倍光镜下，计数阳性细胞，观察5个高倍视野，计数每100个细胞中染色的细胞数。8）取其平均值，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 缪刺对MCAO模型大鼠大脑皮质热休克蛋白70（HSP70）蛋白表达的影响 见表1。

表1 缪刺对MCAO模型大鼠大脑皮质HSP70蛋白表达的影响（±s，n＝8）

表1 缪刺对MCAO模型大鼠大脑皮质HSP70蛋白表达的影响（±s，n＝8）

注：与对照组比较，＃P＜0.05。

组别阳性细胞表达平均数24 h 48 h 72 h模型对照组25.98±7.01 23.87±5.46 22.43±5.96普通针刺组35.03±9.16＃30.43±4.89＃30.11±7.89＃缪刺组 36.55±10.76＃28.47±8.35＃27.28±6.74＃普缪组 38.94±10.77＃34.07±9.13＃32.54±9.63＃

2.2 缪刺对MCAO模型大鼠大脑皮质蛋白激酶B（PKB）蛋白表达的影响 见表2。

表2 缪刺对MCAO模型大鼠大脑皮质PKB蛋白表达的影响（±s，n＝8）

表2 缪刺对MCAO模型大鼠大脑皮质PKB蛋白表达的影响（±s，n＝8）

注：与模型对照组比较，＃P＜0.05。

组别阳性细胞表达平均数24 h 48 h 72 h模型对照组23.59±7.31 26.41±7.76 25.97±10.29普通针刺组32.75±7.43＃37.20±11.48＃37.95±9.42＃缪刺组 30.37±12.36＃35.21±9.67＃35.01±12.14＃普缪组 34.73±13.38＃37.89±12.57＃40.23±12.29＃

3 结论

细胞凋亡是在基因控制下的细胞主动死亡，［2－3］其异常与多种疾病密切相关，如肿瘤、免疫疾病等。［4］从生物全息律医学角度来看，人体整体与局部，局部与局部之间存在着全息对应。［5］缪刺作为一种针刺方法最早出现于《内经》中，是一种左病治右，右病治左针刺方法。缪刺有收摄浮散之正气，开通痞结气机的作用［6］。

［1］徐凌．PKB/Akt及其生理作用的研究进展［J］．国外医学（流行病学传染病学分册），2003，30（4）：233－236．

［2］白雪．晶状体上皮细胞凋亡的实验研究进展［J］．长春中医药大学学报，2006，22（4）：83－84．

［3］马少丹，阮时宝，苑述刚．久泻宁颗粒对大鼠溃疡性结肠炎细胞凋亡及其调控蛋白影响的研究［J］．长春中医药大学学报，2011，27（6）：909－910．

［4］杨旭东，张杰，刘洪凤，等．诱导人胃癌BGC－823细胞凋亡作用及其机制研究［J］．长春中医药大学学报，2010，26（4）：572－573．

［5］王玉明，巨缪刺加艾灸治疗肢体慢性疼痛198例［J］．吉林中医药，2010，30（6）：513－514．

［6］刘雅静，张伯儒，缪刺结合刺络拔罐法治疗顽固性面神经麻痹临床研究［J］．吉林中医药，2008，28（1）：46－47．

R246

A

1007－4813（2013）02－0193－02

2012－12－20）

唐山市科技计划项目支持项目（编号：12140209A－57）。

李雪青（1978－），女，讲师。研究方向：中医学。