学习记忆训练对全脑缺血大鼠认知能力的影响

张军艳 栗延伟 任玉琴 谭 军

新乡医学院第三附属医院神经内二科 新乡 453003

本研究通过建立全脑缺血大鼠模型，观察电迷宫训练对全脑缺血大鼠空间辨别能力的影响，并观测脑源性神经营养因子（brain－derived neurotrophic factor，BDNF）的变化，探讨其可能的作用机制，进而为临床上对患者进行学习记忆训练改善血管性认知障碍（vascular cognitive impairment，VCI）患者的认知功能提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 健康成年雄性SD大鼠，清洁级，体质量（290±40）g，由河南省实验动物中心提供。免疫组化试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。

1.2 实验动物的筛选及分组 大鼠经Y型迷宫测试，将大鼠放入Y型迷宫箱中适应3～5min后，给予适当电击，至其对3臂均探索进入为止，选择活跃、对电击反应较敏感、逃避反应迅速的大鼠进行训练。淘汰掉反应过于迟钝或特别敏感的大鼠。预选出达到连续2次正确反应，电击次数≤3次，对电击反应较敏感的大鼠供实验用。在上述初步筛选的基础上，通过正式迷宫训练4～7d，淘汰达不到学会标准（学不会）的大鼠。将达到学会标准的90只大鼠随机分成3组：假手术组、对照组和训练组，每组30只。

1.3 全脑缺血模型制备 采用改良的Pulsineli 4血管闭塞法制作全脑缺血大鼠模型［1］。假手术组除不电凝椎动脉、不夹闭双侧颈总动脉外，其余过程与手术组相同。造模术后1周，对大鼠进行电迷宫测试，20次／d，连续3d，平均错误次数≥8次作为模型鼠认知障碍的判定标准。造模成功后，根据训练时间的不同将各组再分为7d、14d和21d3组，分别编号、称质量及分笼饲养，每个时间点10只。

1.4 学习记忆训练 采用Y型电迷宫进行学习记忆能力训练。采用固定次数随机不休息法［2］，每轮固定训练20次。每天训练两轮（08：00和20：00），连续训练21d。分别在训练的7d、14d、21d对大鼠进行检测，连测3d取平均值记录每只大鼠错误反应次数、全天总反应时间和潜伏期。

1.5 HE染色和免疫组织化学染色 各组大鼠分别于训练的第7、14、21天进行学习记忆测试后断头取脑，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，片厚5μm。部分石蜡切片常规脱蜡及水化处理后，行苏木素－伊红（HE）染色，二甲苯常规脱水后中性树脂封片，光镜下观察脑组织细胞形态学变化。另取部分石蜡切片经常规脱蜡至水化行免疫组织化学染色。阴性对照用PBS代替一抗。通过彩色图文分析系统，在400倍物镜下每组随机选取5张切片。在每个海马CA1区分别选择5个相邻的视野摄取图像传递至计算机显示屏，分析各组BNDF免疫阳性神经元的平均光密度值以反映BNDF表达的强弱。

1.6 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件包进行数据处理，多组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间点学习记忆能力测试结果 术前各组大鼠的学习能力一致，均达到学会标准，错误反应次数为1.00±0.82，全天总反应时间（89.08±19.07）s，潜伏期（4.45±1.69）s。

训练7d后，与假手术组比较，对照组学习记忆能力明显减退，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，训练组学习记忆能力改善明显（P＜0.05）；与假手术组比较，训练组全天总反应时间和潜伏期延长，差异有统计学意义（P＜0.05），错误反应次数差异无统计学意义（P＞0.05）。

训练14d和21d时，与假手术组比较，对照组学习记忆能力进一步减退。与对照组比较，训练组学习记忆能力进一步改善，各项测试指标差异均有统计学意义（P＜0.05）。训练21d时，与假手术组比较，训练组错误反应次数和潜伏期差异无统计学意义（P＞0.05），全天总反应时间差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、2。

2.2 HE染色观察结果 低倍镜下：假手术组大鼠海马锥体细胞层结构紧密，层次丰富。对照组大鼠海马神经元明显受损，CA1区细胞排列稀疏，细胞线不清晰。训练组神经元排列较对照组稍整齐。高倍镜下：假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞形态规则，略呈锥形，核呈圆形或椭圆形，核膜清楚，核质染色均匀。对照组和训练组神经元可见胞体缩小，胞浆嗜酸性，胞核固缩或溶解。在相应时间点进行神经元计数，训练7d后，与假手术组比较，对照组和训练组细胞核完整的神经元明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。训练14d和21d后，与对照组比较，训练组神经细胞较对照组明显增多（P＜0.05），与假手术组比较，训练组神经细胞数仍较少（P＜0.05）。见图3。

图3 各组大鼠海马CA1区正常神经元计数比较

2.3 各组不同时间点海马CA1区BNDF表达的光密度值比较 光镜下可见BDNF免疫阳性颗粒主要分布在海马CA1、CA3、DG区，呈圆形或椭圆形，大小不一，以胞浆着色为主，阳性产物呈棕黄色颗粒状，部分细胞可见的阳性反应突起。假手术组BDNF免疫阳性神经元相对较少，着色较浅淡。阴性对照用PBS代替一抗，未见阳性产物。训练7d后，与假手术组比较，训练组和对照组海马CA1区BDNF光密度值升高（P＜0.05）。训练14d后，训练组BDNF光密度值升高，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。训练21d后，训练组BDNF光密度值进一步升高，与对照组和假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 3组海马CA1区BNDF免疫阳性神经元结果比较 （）

表1 3组海马CA1区BNDF免疫阳性神经元结果比较 （）

注：与假手术组比较，＃P＜0.05，与对照组比较，＊P＜0.05

组别 光密度值7d 14d 21d训练组 2.0917±0.7656＃ 9.3721±0.8974＃＊ 15.3176±0.8129＊对照组 1.3062±0.4423＃ 6.7289±0.7427＃ 4.9877±0.6075＃假手术组0.7183±0.5519 0.7029±0.5421 0.7146±0.4271

3 讨论

目前已知的与人类认知功能关系密切的大脑组织结构主要有海马、杏仁体以及额颞叶皮层等，其中海马及其周围皮层结构是记忆神经通路的重要组成部分［3］，与人类的学习记忆功能关系最为密切。海马直接参与了信息的储存和回忆，且与空间定位的学习记忆有关，是学习记忆等高级神经活动的重要部分。目前大量研究表明，康复训练对于改善缺血性脑血管病的多种功能障碍有明显的疗效。康复训练是影响脑功能恢复极为重要的因素。本实验中应用Y型电迷宫检测造模前各组大鼠的学习记忆能力一致，均达到学会标准。造模后7d对照组和训练组学习记忆能力明显减退，错误次数增多，全天总反应时间和潜伏期延长，与假手术组比较差异有统计学意义。应用Y型电迷宫训练，与假手术组比较，随着训练时间的延长，训练组的学习记忆能力逐渐改善，而对照组的学习记忆能力逐渐减退，说明全脑缺血后可以造成大鼠的学习记忆能力障碍，而早期进行Y型电迷宫训练可以改善全脑缺血大鼠的学习记忆能力。

BDNF作为神经营养家族成员之一，对多种神经元具有分化、增殖、营养、成熟的作用，具有增强突触联系、增加学习记忆的功能。有关记忆的研究表明，记忆与突触前和突触后的长时程增强效应（long－term potentiation，LTP）明确相关，BDNF能调节突触传递和突触可塑性，改变LTP［4］，增强学习记忆功能，因此在研究中将BDNF作为记忆改善的分子标志物。研究发现应用 Morrsi水迷宫测试BDNF基因敲除的小鼠，发现小鼠存在学习记忆能力缺损［5］。脑缺血损伤后可促进BDNF的升高，从而形成脑缺血后自我保护机制，但BDNF的升高持续时间短暂，有研究发现康复训练亦可促进脑缺血后BDNF升高，袁学谦等［6］对急性脑梗死患者进行早期康复训练后，患者血清BDNF、NGF含量治疗后较治疗前明显升高，且神经功能缺损程度明显减少。王风波等［7］对脑损伤仔鼠采用电针联合丰富康复训练进行干预28d后，发现干预组仔鼠脑皮质BDNF阳性表达明显高于对照组和非干预组仔鼠。本研究发现全脑缺血大鼠对照组和训练组较假手术组海马CA1区BDNF表达均增加，但随着训练时间延长，对照组BDNF表达有下降趋势，但训练组BDNF的表达较对照组明显增加，同时电迷宫测试结果提示训练组大鼠的空间学习记忆能力明显改善。因此，学习记忆训练可以通过增加BDNF，保护海马神经元免受进一步损害，或对已受损的神经元修复有促进作用，从而促进全脑缺血大鼠空间记忆能力的改善。

［1］贾建民，贾建平 .大鼠脑反复缺血致不可逆学习障碍的研究［J］.心理学报，1995，27（1）：69－76.

［2］王跃春 .大鼠Y－型迷宫测试法的筛选与优化［J］.中国行为医学科学，2005，14（1）：50－52.

［3］Laroche S，Davis S，Jay TM.Plasticity at hippocampal to perfrontal cortex synapses：dual roles in working memory and consolidation［J］.Hippocampus，2000，10（4）：438－446.

［4］Mohamd EM，Ahmed HH，Estefan SF，et al.Windows into estradiaol effects in Alzheimer’s disease therphy［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2011，15（10）：1 131－1 140.

［5］McDowell KA，Hutchinson AN，Wong－Goodrich SJ，et al.Reduced cortical BDNF expression and aberrant memory in carf knock－out mice［J］.Neurosci，2010，30：7 453－7 465.

［6］袁学谦，王艳，张莉峰，等 .早期康复训练对急性脑梗死患者血清BDNF、NGF含量及神经功能缺损程度的影响［J］.中国实用神经疾病杂志，2010，13（22）：38－39.

［7］王风波，唐明薇，李晓捷 .电针联合丰富康复训练对脑损伤仔鼠脑皮质脑源性神经营养因子表达的影响［J］.中国康复理论与实践，2012，8（18）：717－720.