Tau蛋白过度磷酸化对阿尔茨海默病微兴奋性突触后电流的影响

林 杭 王伟文 吴渝宪 王 俊 郁 可 杨政辉

成都军区总医院神经内科 成都 610083

本研究有利于阐明tau蛋白过度磷酸化参与阿尔茨海默病发展的具体机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物及分组 20只2月龄健康雄性Wistar大鼠购于四川省医学实验动物研究所，体质量150．2～180g，实验分为实验组（AD模型组）和对照组。实验组：连续6周每天腹腔内注射D－半乳糖50mg／kg，第4周末双侧海马内注射4μg Aβ1－40（以生理盐水溶解）。对照组：连续6周腹腔内注射生理盐水1mL／kg，第4周末双侧海马内注射生理盐水各1μL。

1．2 实验方法 将实验室的温度控制在18～22℃，将2组实验对象分别快速断头，用刀片小心划开大脑并取出海马半脑，快速将海马半脑粘贴在已准备好的切片机载物台上，然后将其放入已备好的0～4℃人工冰水脑脊液（以5%二氧化碳和95%氧气饱和）中。启动切片机，将海马半脑切成400 μm厚度薄片。将切好的海马薄片转至孵槽（孵槽温度为37℃，孵槽内为95%氧气和5%二氧化碳饱和的人工脑脊液）孵育1h，取出薄片在室温下继续孵育1h。将海马薄片移至记录槽中，以2mL／min的流速持续灌注人工脑脊液以及出入水管道，循环液容积设置为50mL，利用拉制仪将硅硼玻璃管拉制成记录电极，电极电阻3．5～5MΩ。全细胞记录采用膜片钳放大器，电刺激脉冲的给出及电信号的采集均通过计算机程序来完成。

1．3 观察指标 记录电极与细胞封接、破膜、稳定15min后，记录40min mEPSCs，观察2组mEPSCs频率、幅值、半衰期以及上升时间、曲线下面积的变化，并进行比较。

1．4 统计学方法 使用SPSS 17．0统计软件进行统计分析，所有实验数据用均数±标准差（±s）表示，2组间比较用独立样本t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 2组mEPSCs频率比较 实验组mEPSCs频率（0．043±0．002）Hz，对 照 组 （0．167±0．006）Hz，2 组 比 较，t＝21．35，P＜0．05。

2．2 2组幅值比较 实验组幅值（7．458±0．381）pA，对照组（14．054±0．356）pA，2组比较，t＝25．62，P＜0．05。

2．3 2组半衰期比较 实验组半衰期（6．724±1．331）ms，对照组（13．289±2．325）ms，2组比较，t＝31．36，P＜0．05。

2．4 2组上升时间比较 实验组上升时间（7．458±0．381）ms，对照组（14．054±0．356）ms，2组比较，t＝19．67，P＜0．05。

2．5 2组曲线下面积比较 实验组曲线下面积（118．903±37．054）pAms，对照组（321．334±87．542）pAms，2组比较，t＝43．45，P＜0．05。

3 讨论

3．1 Tau蛋白过度磷酸化及神经毒性 在阿尔茨海默病患者的脑组织内有3种Tau蛋白，分别是细胞质正常的Tau蛋白、过度磷酸化的Tau蛋白以及聚集成PHF的Tau蛋白。其中PHF－Tau蛋白中已经由各国学者相继鉴定出多个磷酸化位点［2］，这些位点多数位于PHF－Tau蛋白的PRD位置和C端末区，只有极少量的位于MBD区，在这些位点上大多数是苏氨酸和丝氨酸的磷酸化，Tau蛋白在MBD区发生磷酸化可调节微管的稳定性，尤其是产生在Ser262及Ser356两个位点上的磷酸化将显著抑制Tau蛋白的生物学功能，可使Tau蛋白和微管构象发生改变，从而导致细胞骨架破坏，使微管解聚。另有研究显示，Fyn、Syk、Lck和c－Abl都参与了络氨酸残基的磷酸化［2－3］。在病理状态下，也就是阿尔茨海默病患者Tau蛋白发生了过度磷酸化，Tau蛋白的磷酸化程度受多种蛋白激酶调节，在Tau蛋白磷酸化过程中起主要催化作用的激酶有脯氨酸指导的蛋白激酶（PDPK）和非脯氨酸指导的蛋白激酶（non－PDPK），PDPK主要磷酸化丝氨酸和苏氨酸的Ser／Thr、pro位点，non－PDPK主要磷酸化丝／苏氨酸的Ser／Thr、X位点。有研究认为，阿尔茨海默病发病的早期机制是Tau蛋白的过度磷酸化，因NFT尚未形成时，有学者研究发现已出现神经细胞的丢失，且患者的记忆和认知功能出现了损伤，这就说明Tau蛋白过度磷酸化在阿尔茨海默病发生的过程中起关键作用。进一步研究发现，过度磷酸化的Tau蛋白，不仅不能促使微管组装，而且能抵抗蛋白水解酶的作用，从而产生神经毒性，Fulga的研究还发现磷酸化使Tau蛋白大量聚集到肌动蛋白上，因此，过度磷酸化的Tau蛋白有可能转运到树突棘与树突棘上的肌动蛋白相互作用，Tau蛋白通过这种途径使突触后AMPA和NMDA受体发生了改变，导致突触传递效能降低，甚至突触丢失，从而使认知功能受损［4］。Thiese等［5］2007年发现Tau蛋白过度磷酸化引起了树突棘的形态改变和丢失，这些研究均表明Tau蛋白过度磷酸化也许改变了突触的结构和功能，使突触传递效能降低，突触结构和功能的改变会导致阿尔茨海默病的发生。

3．2 Tau蛋白过度磷酸化对微兴奋性突触后电流的作用脑内海马的组织结构跟其他脑内部分的结构略有不同，海马组织内锥体系统按照层状结构整齐排列，其传出纤维和传入纤维相对来说比较单一，是神经电生理研究常用的研究部分，mEPSCs反映了微小兴奋性突触在未受外界刺激的情况下自发进行的电流活动，mEPSCs的频率大小主要反映了突触前谷氨酸的释放量，mEPSCs的幅值主要反映了突触后膜接受的情况。本研究发现，过度磷酸化的Tau蛋白组，其

mEPSCs的频率大小、幅值、半衰期、上升时间、曲线下面积均小于未发生过度磷酸化的Tau蛋白组，说明Tau蛋白过度磷酸化后能减少突触后电流的产生，从而从神经电生理的角度降低了突触的兴奋性，进而降低了患者的记忆力，加速了细胞的凋亡。

［1］Wang JZ，Grundke－Iqbal I，Igbal K．Kinase and phosphatases and tau sites involved in Alzheimer neurofirillary degeneration［J］．Eur J Neurosci，2007，25：59－68．

［2］Zheng－Fischhfer Q，Biernat J，Mandelkow EM，et al．Sequential phosphorylation of Tau by glycogen synthase kinase－3and protein kinase A at Thr212and Ser214generates the Alzheimer－specific epitope of antibody AT100and requires a paired helical filament－like conformation［J］．Eur J Biochem，1998，252：542－552．

［3］Ewers M，Buerger K，Teipel SJ，et al．Multicenter assessment of CSF phosphorylated tau for the prediction of conversion of MCI［J］．Neurology，2007，69：2 205－2 212．

［4］Fulga TA，Elson－Schwab I，Khurana V，et al．Abnormal bundling and accumulation of F－actin mediates tau－induced neuronal degeneration in vivo．Nat Cell Biol，2007，9：139－148．

［5］Thises E，Mandelkow EM．Missorting of tau in neurons causes degeneration of synapses that can be rescued by the kinase MARK2／Par－1［J］．J Neurosci，2007，27：2 896－2 907．