珍稀食药用真菌虎乳灵芝的研究概况

吴吉安，曾念开，CHOONG Yew keong，陈向东

(1.浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所，浙江 杭州 310021;2.海南医学院 药学院，海南 海口 571199;3.Phytochemistry Unit Herbal Medicine Research Centre Institute for Medical Research，Kuala Lumpur Malaysia 50588;4.中国医学科学院＆ 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

虎乳灵芝 (Lignosus rhinocerus)也称虎奶，马来语为cendawan susu rimau (harimau)，英语tiger’s milk mushroom，是一种被马来西亚原住民广泛使用的食药用真菌，被称为马来西亚的国宝，大约有400年的应用历史，民间传说为母虎乳汁滴于地上而生［1-3］。菌核是其药用部位，有止咳定喘、健脾化湿的功效，民间常用于治疗哮喘及咳喘，疗效极佳。中医认为它是一种治疗肝炎、肝热、肝癌、胃病的良药［4］。近年来虎乳灵芝野生资源因过度采挖而逐渐枯竭。菌类学家认为虎乳灵芝是最有开发前途的药用真菌之一［5-6］，人工栽培是解决紧俏出路的有效途径，但至今未见大规模商品化生产。为了加快这一名贵食药用菌的开发，笔者综述了近年来虎乳灵芝的研究状况，以供广大研究者参考。

1 分类学地位和生物学特性

1.1 分类学地位及分布

虎乳灵芝是一种多孔菌，隶属于真菌门担子菌亚门层菌纲非褶菌目多孔菌科虎乳灵芝属［7-10］。我国菌物分类学家称为孤苓，主要分布于马来西亚、菲律宾、斯里兰卡、澳大利亚和东非等，中国分布于海南省保亭黎族自治县［11-12］。Ryvarden［7］在虎乳灵芝属下列出5个种，包括L.dimiticus，L.ekombitii，L.goetzii，L.Rhinocerus 和 L.sacer。最近崔宝凯等［13］在海南尖峰岭发现一个容易和虎乳灵芝混淆的新种L.Hainanensis。相比而言，虎乳灵芝菌管管口较小，有明显阔椭圆形的担孢子。

1.2 形态特征

子实体一年生，单生，有柄。肉革质，盖薄，硬，近圆形，7～11 cm，中凹，上表面淡暗褐色到暗褐色，有同心环纹和放射状皱纹，有细绒毛，边缘不完全或开裂。菌肉白色，约1 mm 厚，菌管白色，长1.5～2.0 mm，孔面白色或浅色，孔口圆形，5～6个·mm-1，菌柄中生，圆柱形，干时浅灰白色到灰色，有细绒毛，长10～14 cm，直径3.0～3.5 cm。菌肉菌丝二体型，生殖菌丝薄壁，2.5～3.5 μm，有锁状联合;骨架-结合菌丝无色，厚壁，树丛状，骨架菌丝柄部直径3～4 μm，分枝末端呈鞭毛状交织，直径1～2 μm。担孢子近球形或近阔椭圆形，透明，光滑，2.5～3.5 μm×3 μm，生于林中地上，从腐殖层下的菌核长出［12］。

1.3 分子鉴定

Tan 等［14］对马来西亚3个不同产地 (相距100 km 以上)来源的5个虎乳灵芝种群进行了rRNA的ITS 测序和比较，显示这些分离菌株有高度相同的ITS。以ITS1 区内的DNA 序列为基础设计了特定的引物，并且和ITS4 primer 配对，可作为特有的基于PCR 的遗传标记物鉴定虎乳灵芝。

1.4 生药鉴定

菌核侧耳在我国俗名为虎奶菇，与虎乳灵芝有着相同的俗称，2种都是能产生菌核的食药用菌，所以易被混淆。为此，杨兰等［15］对2种菌的菌核从形态特征、显微特征、理化性质等方面进行系统观察和鉴别，采用紫外-可见光谱 (UV-Vis)法对2种真菌的乙醇提取物进行表征区分，结果表明两者显微特征有较大差别。虎奶菇的菌丝多数粗短，分枝，相互缠绕成团块;而虎乳灵芝的菌丝多数细长，不分枝，缠绕及附着于类圆形分泌物上、薄层色谱结果显示，虎奶菇至少含有4种或以上的虎乳灵芝至少含有2种或以上的亲脂性的甾体或萜类成分。

1.5 人工培养

1.5.1 固体培养

Lai 等［16］发现菌丝生长的最优条件为30℃，pH 值6～7。在葡萄糖-蛋白胨、酵母蛋白胨葡萄糖培养基上生长最快。加快菌丝生长的碳源和氮源分别是葡萄糖和硝酸钾。在2%葡萄糖为碳源的基础培养基，最适C/N 比为10∶1。

1.5.2 液体培养

虎乳灵芝［17］菌丝在不同pH 值的葡萄糖+酵母粉液体培养基上都会生长，最适培养基pH 为6～7，即中性微偏弱酸，菌丝颗粒大，长势好;pH≤5 或pH≥8 时，菌丝产量明显下降。虎乳灵芝菌丝在不同碳源的培养基下均可生长，较适宜碳源为果糖、葡萄糖和甘露糖;最适氮源为酵母粉，L-胱氨酸为氮源时，菌丝生长受到抑制。

1.5.3 菌核人工栽培

黄年来等［18］仿照一般木腐菌进行代料栽培试验。母种培养用马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)，菌丝初白色，后淡黄白色至淡粉红并带黄褐色，贴于斜面上生长，接种初期每天生长速度2.0～3.5 mm，后期停止生长，变成较坚韧的菌皮。原种生产以750 mL 玻璃菌种瓶为培养容器，木屑麦皮培养基，20～25℃培养30～40 d，菌丝长满全瓶。栽培袋配方为木屑80%，麦皮18%，蔗糖1%，碳酸钙1%或木屑39%，棉籽壳39%，麦皮20%，蔗糖1%，碳酸钙1%，在17 cm×35～38 cm×0.05 mm的聚丙烯塑料袋中，20～26℃下1个半月后菌丝长满全袋，半年后可采收。

2 生物化学与营养

Beng 等［19］分析了静止培养 (SC)和搅拌反应釜 (STR)2种条件下生长的虎乳灵芝的低分子量蛋白 (LMMP)。STR 条件下虎乳灵芝可获得相对较多的蛋白峰。通过表达差异图谱分析，总共获得18个蛋白簇，分子量基本上都在3～9 ku 范围内。共同蛋白有5.8，6.9 和9.1 ku 3个，而特有蛋白，SC 有4个，STR 有9个。蛋白进一步纯化后可以分离到更多的峰，STR 的大部分蛋白分子量在3～8 ku 范围内，而SC 一些蛋白分子量达到了14.3 ku附近。

Wong 等［20］分析比较了虎奶菇、茯苓、虎乳灵芝菌核的非水溶性膳食纤维 (IDF)和水溶性膳食纤维 (DF)的生化和微观结构性质。虎乳灵芝菌核的蛋白含量为 2.75%，灰分 1.52%，脂质0.02%，糖95.7%;IDF 中膳食纤维丰富物质87.1%，残余蛋白1.65%，灰分1.02%;DF 中膳食纤维丰富物质2.51%，残余蛋白1.04%，灰分0.02%;IDF 的糖含量分别是葡萄糖89.6%，氨基葡萄糖1.98%，糖醛酸0.57%，氨基、中性和酸性糖总和92.2%;DF 的糖含量分别是葡萄糖18.6%，甘露糖9.57%，半乳糖0.92%，糖醛酸1.12%，氨基、中性和酸性糖总和29.6%。和虎奶菇、茯苓菌核一样，虎乳灵芝菌核也是典型的糖丰富菌核，粗脂肪含量低。虎乳灵芝菌核拥有大量的IDF，而且非淀粉多糖 (NSP)尤其高，其中葡萄糖是占优势的糖残基。相反，SDF 的得率和NSP非常低。扫描电镜图显示IDF 部分的交织菌丝和不溶性物质，但是只观察到SDF 部分的可溶性物质的非定型物质。相比于SDF 部分，IDF 的显著的高得率和高纯度表明，虎乳灵芝菌核具有作为像麦麸那样普通IDF 的巨大潜力。

Wong 等［21］利用工业食品级的糖降解酶和蛋白水解酶发展了一种用虎奶菇、虎乳灵芝、茯苓菌核制备DF 的方法。为了评价这些菌核DF 在开发富含纤维产品方面的潜力，他们探索了菌核DF 的理化和功能性质，并和当前商业化的DF 进行了比较。通过改良的工业酶等比扩大的AOAC 方法，测定了虎乳灵芝菌核DF 各组分的含量，发现100 g 干物质中包含总膳食纤维 (TDF) (92.7 ±2.88)g，残留蛋白(3.33 ±0.44)g，灰分(1.00 ±0.01)g。100 g 干物质包含的单糖葡萄糖 (84.6 ±2.67)g，氨基葡糖 (2.17 ± 0.21) g，甘露糖 (1.11 ±0.13) g，半乳糖 (0.61 ± 0.02) g，鼠李糖(0.53 ±0.03)g，糖醛酸 (0.51 ±0.06)g，可得的单糖总量 (89.5 ±1.25)g。虎乳菌核DF 的pH值5.69 ±0.01，水合能力 (2.72 ± 0.22)%，脂肪结合能力 (1.87 ±0.02)%，乳化能力 (69.8 ±3.33)%，乳液稳定性 (69.5 ±3.08)%。

在模拟人消化道生理条件下，虎乳菌核制成的膳食纤维对微量元素的结合能力结果显示［22］，除了释放大部分的内源性Ca (97.5% 移除)和Mg(95.7%移除)之外，模拟的胃生理条件也减弱了菌核可能对外源性微量元素的反向结合;通过降低阳离子交换能力，移除大量潜在的微量元素螯合剂，包括蛋白质和肌醇六磷酸。菌核DF 在模拟小肠生理条件下对微量元素结合能力低，特别是Ca和Mg，与其剩余蛋白含量有高度相关性。在结肠模拟生理条件下，pH 值为5.8，轻微酸性，接合钙容易被释放。

在体外，在严格厌氧条件下，以纤维素为对照，虎乳灵芝DF 样品在人粪便匀浆系统 (全部体积为50 mL)中干物质消失13.5%，接近于虎奶菇(8.56%)，而低于茯苓 (53.4%);有机物质消失14.6%，接近于虎奶菇 (9.82%)，而低于茯苓(57.4%)［23］。3种菌核DF 体外发酵的差异原因可能是它们不同数量菌交织 (不同数量的酶不可接近的细胞壁组分)以及β-葡聚糖不同的结构排列(分支的连接及程度)所致。

以乳果糖为对照，从虎乳灵芝菌核中提取的不消化碳水化合物 (NDCs)在体外和Bifidobacterium longum，Lactobacillus brevis，Clostridium celatum 一起培养。24 h 孵育后发现，相比与C.Celatum，NDCs优先刺激了B.Longum 和L.Brevis 的生长［24］。

3 药理活性

急性毒性评价研究显示，按SD 鼠体重250，500 和1 000 mg·kg-1服用虎乳灵芝菌核粉，连续饲喂28 d，结果表明，在生长速率、血液学和临床生化参数 (包括肾脏和肝功能参数)方面没有显示任何副作用。组织学结果显示，处理不会导致动物的肝肾心脾肺发生任何病理变化［25］。

Lai 等［26］从虎乳灵芝菌核中分离了一个溶于热水的多糖 (PR-HW)和溶于冷碱的多糖 (PRCA)，分别是多糖蛋白复合体和葡聚糖，研究了其在体外对白血病细胞株抗肿瘤活性。PR-HW 显示了对急性早幼粒白血病细胞HL-60、慢性髓细胞性白血病细胞K562、人急性单核细胞白血病细胞THP-1 的显著生长抑制;PR-CA 没显示抑制性。流式细胞检测分析显示，PR-HW 对HL-60 的抗增殖效应是通过阻止细胞周期G1 期从而导致了细胞凋亡。他们还研究了虎乳灵芝菌核多糖对人免疫细胞的刺激效应［27］。将菌核多糖PR-HW、PR-CA 分别和人体免疫细胞一起培养，利用RayBio 人细胞因子抗体分析免疫细胞释放到培养基的细胞外细胞因子。研究发现，细胞因子IL-2 和I-309 表达增加(IL-2 和I-309 属趋化因子亚家族，引起单核细胞的趋化性)，藉此PRG 显著地刺激了NK-92MI 细胞的增殖。菌核多糖刺激了CD56+NK 人正常脾、单核细胞/巨噬细胞的增殖。PR-HW 和PR-CA 处理过的免疫细胞表面的葡聚糖受体用dectin-1 和同型抗原的抗体进行染色，流式细胞检测分析显示，NK-92MI 和 MD 细胞的 Dectin-1 表达上调，但CD56+NK 没有。

虎乳灵芝菌核的冷水提取物LR-CW 对人乳腺癌细胞系MCF7 和人肺腺癌细胞系A549 有抗增殖作用，IC50 分别是96.7 和466.7 μg·mL-1。相比较而言，LR-CW 对相应的人正常细胞184 B5 (人胸腺细胞)和NL 20 (人肺细胞)没有显著的细胞毒作用。DNA 断裂研究表明，LR-CW 通过介导细胞凋亡实现对癌细胞的作用。对LR-CW 进行Sephadex G-50 凝胶过滤分离可得到高分子量和低分子量部分。高分子量部分主要由糖类 (68.7%)和少量的蛋白质 (3.6%)组成，低分子量部分则含31%糖类，不含蛋白质。只有高分子量部分对癌细胞显示拮抗作用，IC50 分别是70.0 和76.7 μg·mL-1。因此LR-CW 的细胞毒作用是由于高分子量部分，可能是蛋白质或蛋白-糖复合物［28］。

小鼠巨噬细胞包括RAW 264.7 细胞系和原发性巨噬细胞，用虎乳灵芝菌核热水提取物 (PRW)处理后，功能活性得到增强［29］:胞饮作用显著上调，活性氧和一氧化氮量增加，TNF-α 和iNOS 的增加。通过流式细胞仪确定，酵母来源β-葡聚糖细胞表面受体 (包括Dectin-1，CR3 和TLR2)，发现在PMs 对PRW 的反应中，细胞表面Dectin-1+细胞表达增加。PRW 提高了IKBα 的磷酸化，从而引发NF-κB 信号转导途径，激活了RAW 264.7 细胞系的巨噬细胞。因此PRW 的免疫调节效应可以通过NF-κB 信号转导途径，介导巨噬细胞活性。

Eik 等［30］首次报道了虎乳灵芝的刺激神经突起活性，探讨了菌核水提物对PC-12Adh 细胞株的细胞突起生长活性。结果显示，当菌核水提物浓度在20 μg·mL-1(m/V)时，诱导24.4%细胞突起生长;另外若在30 μg·mL-1(m/V)神经生长因子存在下，可诱导42.1% 细胞突起生长。神经生长因子和菌核提取物在增强细胞突起生长方面有叠加效应。通过用神经细丝蛋白的间接免疫荧光法显示神经细胞的分化，结果显示，水提取物含有神经活性复合物，能在体外刺激细胞突起生长。

4 展望

作为一种名贵药用真菌，特别是西医出身的马来西亚前首相马哈蒂尔在2002年马来西亚国际生物技术大会上提到虎乳灵芝治愈他久咳之病后更是名声大振［31］。中国从事菌类的科研工作者可以和马来西亚相关科研人员一起加强这一具有较高药用价值的中药的研究，以推进虎乳灵芝应用和开发。虎乳灵芝价格昂贵，目前该菌民间使用还只停留在利用野生资源阶段，而野生资源正因无节制采集而日趋减少，应加强虎乳灵芝人工培养技术的研究，人工栽培有良好的社会效益和经济效益，发展前景广泛。

需要加强野生菌种的收集、优异菌株的筛选和驯化工作。优良菌株既是高效栽培的关键因素，也是提取生物活性物质的基础。目前人工栽培虎乳灵芝基本上停留在实验室阶段，未实现规模化生产，产品远远不能满足广大人民群众的需要。因此需要进一步了解其栽培特性，调整栽培条件以提高其生物学效率和缩短生长周期。液体发酵技术可以用于工业化连续生产，规模大、产量高、发酵周期短、生产效率高，因此可以加强虎乳灵芝液体发酵技术的研究，为大规模的工业化生产提供参考。

应加强虎乳灵芝化学成分、药理方面的研究。目前尚缺乏对虎乳灵芝化学成分的系统研究，而且虎乳灵芝的有效成分、特有成分等还有待于明确，对于虎乳灵芝多糖的研究也可继续深入。虎奶菇其菌核和子实体都可用于为食药用，而一般认为虎乳灵芝的子实体没有药用价值，因此需加强该方面的研究，例如明确子实体和菌核成分的区别，虎乳灵芝的最佳采收期等等，以获得最大的食药用价值。

尤其值得指出的是，菌核作为膳食纤维有多个技术上的优势，如天然来源，高的膳食纤维含量和好的物理化学功能特性等，可作为多用途的低热量食物的配料［32］。以菌核为有效部位的食药用菌种类较少，可以充分利用这一特色加强产品开发，满足保健市场需求。

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