99Tcm标记右旋糖苷衍生物DCM-1的淋巴结摄取和显像

李洪玉，梁积新，杨春慧，罗洪义，庄 玲，陈 阳，郑德强，鲁 佳，孙桂全

(1.中国原子能科学研究院 同位素研究所,北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413；3.中国核工业北京四○一医院，北京 102413)

前哨淋巴结(SLN)是指接受淋巴引流的第一级淋巴结。当某原发癌发生淋巴结转移时，最先引起反应的就是SLN。由此可见，SLN的病理学特征可预测并反映该肿瘤的区域淋巴结转移状况，准确识别和定位SLN对病情监测和患者预后评估至关重要。

前哨淋巴结活检(Sentinel Lymph Node Biopsy，SLNB)是获取SLN并进行病理学检查的技术手段。用放射性核素显像法检测SLN是SLNB的常用方法之一[1]，而SLN显像作为放射性核素定位法的一种有效手段，可以为SLNB提供SLN位置、数目及状态的重要信息。SLN显像的成功率很大程度上取决于所采用放射性药物的种类。一种理想的SLN放射性药物应具有如下性质：纳米颗粒且大小均匀；在正常或癌变的SLN中的摄取率高并且滞留时间较长；可从注射点快速清除；较少发生向下一级淋巴结的迁移。目前临床上最常用的SLN显像剂是胶体类药物，如99Tcm-硫胶体、99Tcm-硫化锑、99Tcm-硫化铼，以及其他大分子药物，如99Tcm-人血清白蛋白、99Tcm-右旋糖苷等[2]。然而，这些药物都是非特异性的，主要靠主动扩散作用向淋巴管路转移，药物颗粒最终靠淋巴巨噬细胞的吞噬作用被淋巴结摄取，存在示踪剂颗粒大小不均、注射后至显像的时间间隔不易确定、注射点浓集较高、随时间延长向下一级淋巴结迁移等缺点。

最近的研究[3]表明，甘露糖对淋巴巨噬细胞表面的受体具有亲和作用，99Tcm标记的甘露糖基化右旋糖苷类大分子化合物，由于具有受体结合性质且分子大小较为确定，因而在SLN显像方面体现出较强的应用价值。LymphoseekTM(99Tcm-DTPA-甘露糖基化右旋糖苷)[4]即为近年开发出来的SLN显像剂，目前在国外已进入三期临床研究。Lymphoseek选择了DTPA作为99Tcm的螯合基团，而99Tcm-DTPA配合物仅在大量DTPA配体和过量亚锡离子的存在下才是稳定的，且其化学结构始终存在不确定性，因此，仍有必要研究一种化学结构确定，稳定性和靶向性兼备的SLN药物。

DCM(Dextran-S-Cysteine-Mannose)是指一类连接有半胱氨酸的甘露糖基化右旋糖苷衍生物，化学结构示于图1，其分子通过巯基的硫原子连接了半胱氨酸，S-半胱氨酸基团的氨基可耦联甘露糖基；另一方面，未连接甘露糖基的S-半胱氨酸基团可作为SNO三齿配体与[99Tcm(CO)3(H2O)3]+螯合。通过这种分子设计，DCM类化合物无需连接其他双功能螯合剂，可直接进行99Tcm的标记[5]。

相关的生物分布实验和显像研究表明，该类锝标记的DCM配合物与未连接甘露糖基的DC(Dextran-S-Cysteine)配合物相比较，在SLN的摄取大大提高，体现出了受体结合的特点，但注射剂量是关键因素[6-7]。

本研究用羰基锝标记了DCM-1，得到99Tcm-(CO)3-DCM-1，并进行正常鼠淋巴结中的分布和显像研究，重点考察不同注射剂量的99Tcm-(CO)3-DCM-1对正常鼠淋巴结摄取及体内分布的影响。

1 实验材料

1.1 主要仪器

99Mo-99Tcm发生器：原子高科股份有限公司产品；FH463A自动定标器、FT-603型闪烁探头：北京核仪器厂；CRC15R放射性活度计：美国CAPINTEC公司；微量注射器：美国 Hamilton公司；高效液相系统：ProStar 210型，美国Varian公司；HPLC放射性检测器：德国Raytest公司；Milli-Q高纯水制备系统：美国MILLIPORE公司。

图1 右旋糖苷衍生物DCM-1的化学结构Fig.1 The structure of dextran mannose conjugates: DCM-1

1.2 主要试剂

Isolink药盒：由Mallinckrodt-Tyco公司生产并赠送；右旋糖苷衍生物DCM-1：希腊放射性核素和放射性显像产品研究所的Ioannis Pirmettis博士合成，法国Roberto Pasqualini博士提供；专利蓝溶液(2.5%)：Roberto Pasqualini博士提供；其他试剂均为国产分析纯，实验用水均为二次去离子水。

1.3 实验动物

Balb/C小白鼠：随机分组，每组5只，雌雄兼用，18～22 g；Wistar大鼠：随机分组，每组3只，雌雄兼用，180～220 g；动物均为清洁级，由中国医学科学院实验动物研究所提供。

2 实验方法

2.1 [99Tcm(CO)3(H2O)3]+ 的制备

向Isolink药盒中加入1 mL新鲜的 Na99TcmO4洗脱液(37～370 MBq)，于95 ℃反应25～30 min，间歇振荡，反应结束后，冷却到室温，用 PBS-HCl缓冲液(0.64 mol/L，pH为2.5)调节pH为7.5～8.5。

2.2 DCM-1的99Tcm标记[5]

将1 mL [99Tcm(CO)3(H2O)3]+溶液 (37～370 MBq)加入到含有400 μg DCM-1冻干品的瓶中，于75 ℃反应30 min，冷却，即得标记化合物99Tcm-(CO)3-DCM-1。

2.3 99Tcm-(CO)3-DCM-1的放化纯度测定

采用高效液相色谱法(HPLC)分析测定标记物的放化纯度，HPLC分析条件：C-18色谱柱(Hypersil ODS2，4.6 mm×250 mm)，紫外检测器波长为254 nm，流速为1 mL/ min。淋洗液组成：流动相A : 0.1%TFA/H2O，B: 0.1%TFA/MeOH；淋洗梯度：0～4 min，0～0%B；4～6 min，0～25%B；6～17 min，25%～100%B；17～25 min，100%B；25～30 min，100%～0B；30～35 min，0B。

总体上说，在公路桥梁建设过程中，预应力的使用是一项长期且复杂的工程，技术要求高，每个环节都要求精准把握，因此，针对这项技术的实际应用，需要根据项目的实际特点，采用正确的方式进行。不断提高施工作业的精度和准度，提升施工工艺，保障各项施工工艺始终符合行业标准和具体施工需求。从而全面提高预应力在我国公路桥梁中的具体作用。

2.4 99Tcm-(CO)3-DCM-1的稳定性

将标记溶液用生理盐水稀释80倍，于室温下静置5 h，用HPLC分析放化纯度，考察其体外稳定性。将99Tcm-(CO)3-DCM-1由小鼠脚垫皮下注射，1 h后取尿液离心后取上层澄清液进行HPLC分析，考察其体内稳定性。

2.5 99Tcm-(CO)3-DCM-1在正常鼠体内的生物分布

取健康Balb/C小鼠，随机分组，每组5只；Wistar大鼠，随机分组，每组3只。标记物用生理盐水稀释，经正常鼠的右后足脚垫进行皮下注射，注射液放射性浓度为3～37 GBq/L。注射后按摩脚掌30 s以利于药物吸收，分别于处死前10 min在给药同侧的脚垫处皮下注入专利蓝溶液，再按摩脚掌30 s。给药后1、4 h处死动物，取SLN(即腘窝淋巴结，popliteal lymph node)、次级淋巴结(即腰淋巴结，2LN)、注射点(即右后足，injection site)、肝、脾、血等，肝、脾、血称重，测量各器官或组织的放射性计数，计算放射性摄取率(SLN、2LN、注射点单位为%ID，肝、脾、血的单位为%ID·g-1),并计算SLN提取率(popliteal extraction rate,PE%)，公式如下：

PE%=[(SLN摄取率-2LN摄取率)/SLN摄取率]×100%

PE%体现了药物在SLN滞留的比率，该值越大，说明药物在SLN的滞留越强，向下一级淋巴结迁移的可能性越小。

2.6 正常大鼠体内的淋巴结显像

取Wistar大鼠，每3只一组，每只右后足脚垫皮下注射不同剂量的标记物，分别在注射后不同时间点进行显像，显像前10 min经腹腔注射0.8 mL 10%水合氯醛溶液对大鼠进行麻醉。显像数据在计算机系统128×128矩阵中进行记录与分析，放大倍数：1，采集计数：50 K/只。

3 结果与讨论

3.1 99Tcm-(CO)3-DCM-1的制备及稳定性

将99Tcm-(CO)3-DCM-1溶液用生理盐水稀释80倍，于室温下静置5 h，放化纯度仍>90%，说明99Tcm-(CO)3-DCM-1体外稳定性较好。给药后1 h，尿液的HPLC分析图谱示于图2d，结果显示，主峰保留时间未变，99Tcm-(CO)3-DCM-1在小鼠体内未发生分解。

3.2 99Tcm-(CO)3-DCM-1在正常鼠体内的生物分布

将99Tcm-(CO)3-DCM-1分别以每25 μL 2 μg、每5 μL 2 μg、每5 μL 0.2 μg、每5 μL 0.05 μg和每5 μL 0.005 μg剂量注入Balb/C小白鼠体内，99Tcm-(CO)3-DCM-1在Balb/C小白鼠体内的生物分布结果列于表1。

a——[99Tcm (CO)3(H2O)3]+ ；b——99Tcm-(CO)3-DCM-1；c——99Tcm-(CO)3-DCM-1稀释80倍；d——99Tcm-(CO)3-DCM-1小鼠代谢的尿样品图2 各种样品的HPLC图 a——[99Tcm (CO)3(H2O)3]+ ；b——99Tcm-(CO)3-DCM-1；c——99Tcm-(CO)3-DCM-1 (80 times dilution)；d——the mice’s urine sample of 99Tcm-(CO)3-DCM-1 metabolismFig.2 Radio-HPLC profiles of the samples

注射后时间组织或器官Balb/C小鼠体内的放射性摄取率2 μg(25 μL)2 μg(5 μL)0.2 μg(5 μL)0.05 μg(5 μL)0.005 μg(5 μL)SLN3.18±0.186.12±0.764.34±1.436.47±1.456.37±0.862LN2.16±0.414.88±1.521.75±0.670.22±0.140.54±0.09注射点30.68±8.3340.51±8.6116.73±1.1854.23±2.2476.65±4.141 h肝23.34±3.5029.02±3.004.05±0.891.34±0.272.61±0.34脾13.82±3.621.79±0.320.12±0.090.23±0.130.16±0.07血2.93±0.442.23±0.530.01±0.000.04±0.041.09±0.13SLN提取率PE%32.120.359.796.691.5SLN3.47±1.027.69±1.575.19±1.474.32±0.917.08±0.802LN2.07±0.474.51±1.070.78±0.450.20±0.090.69±0.37注射点36.09±3.0934.90±3.0821.41±1.6544.58±3.2670.29±3.244 h肝21.60±3.2936.65±2.384.58±0.551.17±0.413.24±0.14脾15.41±3.482.82±0.430.16±0.070.25±0.280.21±0.03血1.27±0.071.33±1.510.00±0.010.04±0.061.06±0.14SLN提取率PE%40.341.485.095.490.3

注：SLN、2LN、注射点摄取率的单位为%ID；肝、脾、血摄取率的单位为%ID·g-1

由表1可见，注射剂量，包括注射化学量和注射体积，对99Tcm-(CO)3-DCM-1在Balb/C小白鼠体内的SLN摄取具有显著影响。当注射药物化学量保持不变，而注射体积由25 μL 减少到5 μL时，SLN 的摄取几乎增加了一倍，注射后1 h从3.18%增至6.12%，注射后4 h从3.47%增至7.69%，存在显著差异(P<0.001)。当注射体积保持不变，而注射药物化学量由2 μg减少到0.05 μg时，SLN 的摄取也会提高，同时2LN的摄取减少到只有0.22%，相应的SLN提取率PE%从20%～40% 增长到90%以上，说明向次级淋巴结的迁移随注入化学量的减少而减少。然而，实验结果也表明，注射剂量并不是越低越好，当注射剂量减少到每5 μL 0.005 μg时，SLN摄取率和提取率PE%均出现下滑，而注射点的滞留却明显增加。当注射剂量相对较小时，如每5 μL 0.05 μg时，生物分布较理想，SLN摄取较高，而其他组织或器官(除注射点)摄取较低。

另外，分别以每30 μL 0.05 μg和每5 μL 0.05 μg的剂量注入Wistar大鼠体内，得到99Tcm-(CO)3-DCM-1在Wistar大鼠体内的生物分布结果列于表2。

在Wistar大鼠生物分布实验中得到了与小鼠相似的实验结果，注射剂量减少时，SLN的摄取增加，如表2所示，注射化学量为0.05 μg、注射体积30 μL时，SLN的摄取率达到15%～17%，当注射体积由30 μL 减少到5 μL(注射化学量相同)时，SLN的摄取率几乎增加一倍，达到30%～32%，而且药物向下一级次淋巴结的迁移较小，PE%均在95%左右，但不得不注意到，仍有约50%的药物滞留在注射点。注射剂量0.05 μg(30 μL)和0.05 μg(5 μL)时所得数据经对照，具有统计学意义(P<0.01)，差异显著。

以前的研究表明，注射剂量是影响前哨淋巴结显像药物生物分布的关键因素，并应在可行的前提下尽量降低注射体积[8]。注射体积增大，会降低淋巴结对药物的摄取；而减少注射化学量，会降低肝和血液中的摄取并减少药物向下一级淋巴结的迁移。适量降低注射剂量有利于提高SLN的摄取率和2LN提取率，但也并不是越低越好，降低注射剂量，意味着要对药物进行大量稀释，有可能造成药物分子相互聚集，形成聚合大分子而滞留在注射点，因此需要进行综合考虑，从而确定最佳注射剂量。

表2 99Tcm-(CO)3-DCM-1在Wistar大鼠体内的生物分布

注：SLN、2LN、注射点摄取率的单位为%ID；肝、脾、血摄取率的单位为%ID·g-1

3.3 Wistar大鼠的淋巴结显像

99Tcm-(CO)3-DCM-1分别以剂量a：0.5 μg每50 μL(2.1×106Bq)和剂量b：1.0 μg每50 μL(4.1×106Bq)的注射剂量注射Wistar大鼠，进行显像，显像结果示于图3。

a组——0.5 μg(50 μL)；b组——1.0 μg(50 μL)图3 99Tcm-(CO)3-DCM-1在Wistar大鼠体内显像图Fig.3 SPECT images pictures of 99Tcm-(CO)3-DCM-1 in Wistar rats

由图3可以看出，显像与生物分布的结果一致，99Tcm-(CO)3-DCM-1具有较高的SLN摄取，注药后10 min，SLN即已显影，随后各个时间点，SLN显像均非常清晰；虽然在注射点仍有较强滞留，但并不影响对SLN的观察；而随时间延长，可看到有小部分放射性向2LN迁移，膀胱与2LN显影会发生重叠，但即使给药2 h后，仍未见放射性向第三淋巴结的转移；全身放射性本底较低，可见肝区轻微显影。当注射化学量从0.5 μg增加到1.0 μg时，SLN摄取有所下降，肝区显影略加重。

4 结 论

用[99Tcm(CO)3(H2O)3]+标记甘露糖基化的右旋糖苷衍生物DCM-1，标记过程简单，标记率大于90%。99Tcm-(CO)3-DCM-1在SLN的摄取较高，在大鼠的分布实验中，SLN的摄取达30%以上，显像实验可见SLN清晰显影；向下一级淋巴结的迁移较少，PE%最高可达97.7%。淋巴结摄取对注射剂量很敏感，当注射剂量减少时，SLN的摄取率和PE%都相应提高。结果表明，99Tcm-(CO)3-DCM-1具有较高的前哨淋巴结摄取及优良的体内分布性质，具备应用于前哨淋巴结显像的潜在价值，值得进一步的研究。

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