稳定同位素技术研究湿地甲烷产生的微生物过程进展

李 清，林光辉

(1.清华大学 地球系统科学中心 地球系统数值模拟教育部重点实验室，北京 100084;2.清华大学 深圳研究生院，海洋材料与技术学部，深圳 518055)

在经历了约十年的平稳期后，2007年开始全球大气甲烷浓度又出现增长，而且增长主要来自北半球[1]。Kai[2]通过大气甲烷稳定同位素监测、大气反演、地球系统模型预测等多种研究手段综合分析认为，全球甲烷过去十年排放量增速出现下降的主要原因是北半球微生物资源减少，其中，亚洲特别是中国水稻田甲烷排放量的下降可能是主导因素[2]。Bousquet[3]研究发现，湿地甲烷排放量的变化是过去20年全球甲烷排放出现年际间波动最重要的原因。1999年以来，全球湿地甲烷排放量的下降抵消了人类活动引起的大气甲烷浓度上升，如果湿地甲烷的排放量恢复到1990年的高排放量水平，全球大气甲烷的浓度将在经历这短暂的稳定之后重新开始增长[3]。古气候学家的研究[4]也发现，最后一次冰期的消失更可能是由于北半球湿地的甲烷排放引起而非甲烷冰的融化。这些研究均说明了全球湿地特别是北半球湿地甲烷排放对于调节大气甲烷浓度变化具有十分重要的作用。

湿地仅占陆地面积6%～7%，但其碳含量却占陆地土壤碳储量的68%[5]，净初级生产力占全球的10%。湿地由于较低的有机质分解率和较高的生产力而成为重要的碳汇，但同时也是重要的甲烷排放源。根据政府间气候变化专门委员会(Intergovernmental Panel on Climate Change,IPCC)2007年的评估结果，湿地甲烷排放量占全球甲烷排放量的20%～39%。对于全球湿地甲烷的排放，目前不同的估算结果相差较大[6]。例如，Cao[7]利用过程模型研究发现，全球湿地的甲烷排放量为145 Tg·a-1，其中，天然湿地的排放量为92 Tg·a-1，水稻田的排放为53 Tg·a-1[7]。然而，Walter[8]对天然湿地的甲烷排放计算的结果则达到260 Tg·a-1，其中约60%释放到大气中，其他部分在排放到大气之前就已经在土壤中被氧化了[8]。而Bastviken[9]研究发现，尽管未被计算在全球温室气体通量中，陆地湖泊、水库和河流的总甲烷排放量事实上达到了103 Tg·a-1，大约抵消了目前陆地碳汇总量的25%[9]。

这种差异产生的重要原因是不同类型和不同区域湿地甲烷排放的空间格局以及随时间的动态变化信息比较缺乏。而要得到这些结论，除了需要建立更多的甲烷通量数据监测网络外，还需要对湿地甲烷产生的微生物过程进行深入的研究，从而为甲烷过程建模和通量数据分析提供支撑。

尽管国际上关于产甲烷相关微生物的研究非常多，以产甲烷菌(Methanogens)或甲烷氧化菌(Methanotrophs) 作为主题词搜索web of knowledge，查找到的文献超过10 000篇，但大多集中在微观生物学领域。与全球变化以及温室气体产生机制等主题相关的研究主要包括甲烷相关微生物的种群多样性和群落结构随环境因子变化响应情况[10]，包括对水位变化的响应[11]，对温度变化的响应[12]，对营养元素浓度变化的响应[13]，以及甲烷相关微生物在土壤中的垂直分布情况[14]，产甲烷细菌的数量随着季节变化以及土壤深度而变化[15]等。对于甲烷通量的空间格局与甲烷相关微生物的群落结构之间的直接关系研究还比较缺乏。而事实上，如果将产甲烷菌的数量、种群变化规律与甲烷排放量的变化直接相关联将更具有科学与现实意义[16]。

本文在简要介绍湿地甲烷产生的基本微生物过程后，重点阐明如何利用稳定同位素技术研究产甲烷的不同途径和不同微生物种类在甲烷产生过程的作用，并分析该领域的最新研究进展和未来研究重点，以期为我国开展这方面的研究提供一些信息。

1 甲烷产生的基本微生物过程及其对甲烷排放计算的意义

目前的研究表明，湿地排放的甲烷主要是由产甲烷微生物在厌氧条件(Eh值小于-200 mV)下把乙酸、CO2或甲醇等作为电子受体，乙酸或H2作为电子供体，发生氧化还原反应而产生的，有机物分解产生甲烷的过程示于图1。

其中，乙酸和H2是产甲烷微生物所利用的主要基质，其他的基质对于甲烷产生的贡献一般不超过5%[18]。根据使用基质的不同，产甲烷微生物可以分为CO2型、甲基型和乙酸型三大类，产甲烷微生物的三种类型列于表1。

图1 有机物分解产生甲烷的过程[17] Fig.1 Methane production pathways during organic matter decomposition[17]

类型所利用的基质代表性微生物CO2型CO2、CO和甲酸盐甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium)产甲烷球菌(Methanococcus)甲基型甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺甲硫醇和二硫醇甲烷八叠球菌(Methanosarcins)甲烷八叠球菌(Methanosarcina)乙酸型醋酸盐甲烷丝菌(Methanothrix)鬃毛甲烷菌(Methanosaeta)

由于产甲烷微生物不能直接利用复杂化合物，因而其生存必须依赖其他至少三类微生物的存在，包括水解、发酵以及产氢产乙酸细菌。

以上分析可见，甲烷的产生主要由以下三个反应决定的：

CH3COOH→CO2+CH4

(1)

CO2+4H2→2H2O+ CH4

(2)

4 CH3OH→H2O+ CO2+3CH4

(3)

因而甲烷产生总量m可以表示为：

m=ma+mc+mi

(4)

或者

m=(fma+fmc+fmi)m，同时fma+fmc+fmi=1

(5)

其中，m代表甲烷产生的总量或者速率，ma代表来自于醋酸的甲烷，mc代表来自于CO2的甲烷，mi代表来自于其他化合物比如甲醇的甲烷；fma则表示来自于醋酸的甲烷的占总甲烷的比例，fmc表示来自于CO2的甲烷占总甲烷的比例，fmi则表示来自于甲基化合物等其他途径的甲烷占总甲烷的比例。

由于反应(3)的发生主要是在高盐的环境中，且甲烷的产生量很低[19]，因而在大多数情况下甲烷的产生来自反应(1)和反应(2) ，因而上述方程可以进一步简化为：

ma=(1-fmc)m

(6)

已有研究发现，fmc在不同的环境条件下不一样，而且受到温度、植被种类和富营养化程度等多个因素的影响[20]，因而fmc是计算甲烷产生的各种过程模型中十分重要的参数。

2 稳定同位素技术在产甲烷途径贡献分析中的应用

目前，对于fmc的计算主要有3种方法[19]：(1) 放射性同位素示踪，例如用14C标记区分碳酸氢根和醋酸中的碳然后测定产生的甲烷中的14C丰度进而计算碳酸氢根和醋酸各自的转化速率；(2) 利用特异性的抑制剂比如CH3F抑制利用醋酸产生甲烷的反应，此时产生的甲烷则认为是来自于CO2；(3)利用稳定同位素的分馏效应，通过测定产物和底物的同位素比值来计算不同产甲烷途径对于总甲烷的贡献率。其中，方法(3)由于操作简单，受实验条件以及环境的影响小且更加精确而成为目前计算fmc最重要的方法之一[19]。

不同的产甲烷途径中的同位素分馏过程如图2所示，因而在不考虑反应(3)的发生时，可以得到以下质量平衡方程：

δCH4=fmcδmc+ (1-fmc)δma

(7)

解上述方程可得到:

fmc= (δCH4-δma) / (δmc-δma)

(8)

图2 甲烷产生过程中的同位素分馏[19] Fig.2 Isotopic fractionation in methane producing processes[19]

如果甲烷产生反应的同位素效应是确定的，则：

δma=δac+Δma

(9)

δmc=δCO2+ Δmc

(10)

而对于反应A→B，通常需要定义一个同位素分馏因子αAB:

αAB= (δA + 103) / (δB + 103)

(11)

所以αma和αmc可以分别表示为：αma= (δac+ 103) / (δma+ 103)

(12)

αmc= (δCO2+ 103) / (δmc+ 103)

(13)

即δma和δmc可以重新表示为：

δma=(1/αma)(δac+ 103-αma103)

(14)

δmc=(1/αmc)(δCO2+ 103-αmc103)

(15)

由以上分析可见，不考虑反应(3)的情况下，根据方程(8)、 (14)和(15)，如果已知αma和αmc的值，则fmc可以很容易通过测定CH4、CO2和乙酸甲基中的δ13C来确定。利用稳定同位素信号进行产甲烷途径贡献分析的研究总结列于表2，由表2可见，目前关于δac的信息十分缺乏，仅在Cape Lookout Bight和日本的水稻田土壤中有所研究，还有一些研究测定了总乙酸的δ13C，由于乙酸羧基和乙酸甲基的δ13C相差超过14‰[19]，总乙酸的δ13C对于fmc的准确计算意义不大。

表2 利用稳定同位素信号进行产甲烷途径贡献分析[19]

另一方面，αma和αmc在研究中更难被确定。由于很多中间值不容易得到，通常用简单的参数αc来对不同产甲烷途径的贡献进行区分。定义αc= (δCO2+ 103) / ( δCH4+ 103)，通过对αc进行计算得出：当αc>1.065时，CO2途径占主导；而当αc<1.055时，乙酸途径占主导[21]。然而，这种方法只能进行粗略的定性区分，无法得到fmc的精确值。

为了精确计算fmc，可以利用特定培养基分别培养利用不同途径产甲烷的微生物，希望对αma和αmc进行精确计算[19]。然而，αma和αmc受微生物种类、温度以及可利用的H2浓度等因素影响变化很大，其中αmc在1.031～1.077，αma在1.007～1.027[19]。尽管范围变化很大，但是能够很清楚的看出αmc要显著的大于αma。这些结果部分验证了前文中对αc的计算得出的结论，同时也指出αma和αmc在各种特定类型生态系统中的确定还需要更多深入研究。

3 同位素标记技术在产甲烷微生物功能研究中的应用

由于αma和αmc受微生物种类的影响很大，因而对不同类型湿地中的微生物群落结构进行分析，特别是对产甲烷微生物种类、种群大小以及其功能情况进行研究将对αma和αmc的计算提供重要信息。利用分子生物学技术能够对土壤微生物的种群数量、种群大小甚至功能基因的表达丰度等进行定性或半定量分析，比如Godin[22]利用末端限制性片段长度多样性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism ，T-RFLP)分析方法发现,泥炭地甲烷产生速率与产甲烷菌群落丰富度之间在春季没有相关性，但是生长季节存在明显相关关系，但这种分析更多的是起到指示和推测微生物在环境中的功能[22]，难以将这些参数与微生物具体代谢反应过程间建立直接联系。同位素标记技术与分子生物学技术的结合为建立微生物的群落结构、功能结构与代谢功能之间的关系研究提供了可能[22]。

John[24]利用放射性同位素14C标记法和T-RFLP法分别研究了盐沼不同土壤深度的产甲烷微生物对不同类型底物的利用速率和产甲烷微生物的种群变化，表层土壤甲胺的利用速率最快，与此同时，表层土壤微生物的分布则以利用甲胺的甲烷八叠球菌(Methanosarcinales)的种群数量占据主导。深层土壤则是乙酸的利用速率最快，而同时主要利用乙酸的鬃毛甲烷菌(Methanosaeta)的种群数量占据主导地位[23]。

目前同位素标记中应用最为广泛的是稳定同位素探测技术(Stable Isotope Probing，SIP)，是指一类利用稳定同位素(比如13C，15N)标记微生物所利用的基质，然后对微生物经过代谢反应后被标记DNA或RNA等进行分析的技术，根据检测的分子不同进而区分为DNA-SIP和RNA-SIP[24]。Lu等[26]在水稻田中加入13C标记的CO2后研究发现，水稻根系土壤中一类被称为Rice ClusterⅠ的产甲烷微生物RNA中13C的比例显著升高，说明其利用了水稻根呼吸产生的CO2，因而在水稻田甲烷产生中可能起着重要作用，尽管与其他几种产甲烷微生物相比，其在水稻土壤中的相对数量并不是最高的[25]。这个结果显示了同位素标记技术相对分子生物学技术的优势，如果利用T-RFLP法对水稻根系周围的产甲烷菌的种群数量进行研究，Rice ClusterⅠ会因为种群数量偏低而被认为其对水稻田甲烷产生的贡献也偏低，如果将不同产甲烷途径的贡献率和同位素标记的结果结合起来，水稻田产甲烷微生物的种群数量和实际代谢功能与甲烷通量之间的关系将更加明确。Conrad 等[27]通过测定CO2和CH4的稳定同位素比值来粗略估算CO2途径和乙酸发酵途径的相对产甲烷贡献率并结合T-RFLP技术发现，温度高于40 ℃时，土壤产甲烷以完全CO2还原途径为主，而温度低于30 ℃时，CO2还原途径和乙酸还原途径同时存在[26]。Conrad等的研究很好的结合稳定同位素分馏效应和分子生物学技术，但没有测定土壤乙酸中甲基的碳同位素比值，因而只能对不同产甲烷途径的贡献率进行粗略计算。

4 展 望

全球甲烷排放在2007年前的十年中增长速率下降，这引发了科学家们激烈的争论，但参与讨论的主要是大气科学家，尽管湿地和微生物的作用可能是决定性因素[2]，而湿地生态学家和微生物学家参与程度却并不高。微生物种群的复杂性、微生物种群大小与其实际代谢功能之间的非线性关系、研究手段的缺乏可能是主要原因。由于研究手段的限制，利用稳定同位素分馏效应对不同类型的湿地中各种产甲烷途径的比重进行精确分析还需要付出巨大的努力，尤其是αma和αmc受到的影响因素十分复杂，因而对于不同类型湿地中αma和αmc的确定将是甲烷产生相关微生物过程的研究重点。与此同时，尽管基因组学研究的发展和应用使微生物种群多样性有了更为深入的研究，但许多微生物的代谢功能仍然很难确定[22]，即便是已经进行了全基因组测序基因组的模式生物大肠杆菌(E. coli)基因组中仍然有大约50%的基因其功能是未知的[27]。而同位素标记技术特别是最近发展的SIP技术能够通过标记微生物利用的底物来对微生物在环境中的功能进行研究。因此，如果将分子生物学技术、SIP和稳定同位素分馏效应等结合起来，可以更为深入研究湿地甲烷产生的微生物过程以及其与环境因子之间的关系，为减小湿地甲烷排放量估算的不确定性提供机理上的信息。

参考文献:

[1] Rigby M, Prinn R, Frase P，et al. Renewed gro-wth of atmospheric methane[J]. Geophysical Research Letters, 2008， 35:L22805.

[2] Kai FM, Tyler SC, Randerson JT, et al. Reduced methane growth rate explained by decreased Northern Hemisphere microbial sources[J]. Nature, 2011， 476:194-197.

[3] Bousquet P, Ciais P, Miller JB, et al. Contribution of anthropogenic and natural sources to atmospheric methane variability[J]. Nature, 2006， 443:439-443.

[4] Fischer H, Behrens M, Bock M, et al. Changing boreal methane sources and constant biomass burning during the last termination[J]. Nature, 2008， 452:864-867.

[5] Schlesinger WH. Biogeochemistry: an analysis of global chang[M]. Academic press, 1997.

[6] Solomon S. Climate change 2007: the physical science basis: contribution of Working Group I to the Fourth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change[M]. Cambridge Univ Pr, 2007.

[7] Cao M, Gregson K, Marshall S. Global methane emission from wetlands and its sensitivity to climate change[J]. Atmospheric Environment, 1998， 32:3 293-3 299.

[8] Walter B, Heimann M, Matthews E. Modeling modern methane emissions from natural wetlands. I- Model description and results[J]. Journal of Geophysical Research D Atmos, 2001， 106:34.

[9] Bastviken D, Tranvik LJ, Downing JA, et al. Freshwater methane emissions offset the continental carbon sink[J]. Science, 2011， 331:50.

[10] Yavitt JB, Yashiro E, Cadillo-Quiroz H, et al. Methanogen diversity and community composition in peatlands of the central to northern Appalachian Mountain region[J].North America Biogeochemistry, 2012， 109:117-131.

[11] Yrjälä K, Tuomivirta T, Juottonen H, et al. CH4production and oxidation processes in a boreal fen ecosystem after long‐term water table drawdown[J]. Global change biology, 2011， 17:1 311-1 320.

[12] Kim SY, Freeman C, Fenner N, et al. Functional and structural responses of bacterial and methanogen communities to 3-year warming incubation in different depths of peat mire[J]. Applied Soil Ecology, 2012, 57:23-30.

[13] Eriksson T, Öquist MG, Nilsson MB. Production and oxidation of methane in a boreal mire after a decade of increased temperature and nitrogen and sulfur deposition[J]. Global change biology, 2010, 16:2 130-2 144.

[14] Cadillo‐Quiroz H, Bräuer S, Yashiro E, et al. Vertical profiles of methanogenesis and methanogens in two contrasting acidic peatlands in central New York State, USA[J]. Environmental Microbiology, 2006, 8:1 428-1 440.

[15] 汤博, 唐杰, 吴俐莎, 等. 若尔盖高原产甲烷菌数量的时空差异性[J]. 微生物学通报, 2010, 37:1 706-1 711.

Tang Bo, Tang Jie, Wu Lisha, et al. Time-space change of methanogen amount from zoige plateau[J]. Microbiology China, 2010, 37: 1 706-1 711(in Chinese).

[16] 金城. 高原湿地产甲烷菌[J]. 微生物学通报, 2010， 37:1 705.

Jin Cheng. Methanogensin zoige wetland[J]. Microbiology China, 2010, 37:1 705(in Chinese).

[17] Reddy KR， DeLaune RD. Biogeochemistry of wetlands: science and applications[M]. CRC, 2008.

[18] Segers R. Methane production and methane consumption: a review of processes underlying wetland methane fluxes[J]. Biogeochemistry, 1998， 41:23-51.

[19] Conrad R. Quantification of methanogenic pathways using stable carbon isotopic signatures: a review and a proposal[J]. Organic Geochemistry, 2005， 36:739-752.

[20] Conrad R. Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments[J]. Fems Microbiology Ecology, 1999， 28:193-202.

[21] Hornibrook ERC, Longstaffe FJ, Fyfe WS. Evolution of stable carbon isotope compositions for methane and carbon dioxide in freshwater wetlands and other anaerobic environments[J]. Geochimica Et Cosmochimica Acta, 2000， 64:1 013-1 027.

[22] Godin A, McLaughlin JW, Webster K， et al. Methane and methanogen community dynamics across a boreal peatland nutrient gradient[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2012, 48: 96-105.

[23] Chen Y, Murrell JC. When metagenomics meets stable-isotope probing: progress and perspectives[J]. Trends in microbiology, 2010, 18:157-163.

[24] John PR, Brock F, Banning N, et al. Changes in methanogenic substrate utilization and communities with depth in a salt-marsh, creek sediment in southern England. Estuarine[J]. Coastal and Shelf Science, 2012, 96: 170-178.

[25] Dumont MG, Murrell JC. Stable isotope probing - linking microbial identity to function[J]. Nature Reviews Microbiology, 2005， 3:499-504.

[26] Lu Y， Conrad R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere[J]. Science, 2005， 309:1 088-1 090.

[27] Conrad R, Klose M, Noll M. Functional and structural response of the methanogenic microbial community in rice field soil to temperature change[J]. Environmental Microbiology, 2009， 11:1 844-1 853.

[28] Serres MH, Gopal S, Nahum LA,et al. A functional update of the Escherichia coli K-12 genome[J]. Genome Biol, 2001， 2:1-35.