电针对氯胺酮成瘾大鼠内侧前额叶皮质酪氨酸羟化酶表达的影响

缪化春 吴 锋 熊克仁

（皖南医学院解剖学教研室，安徽 芜湖241002）

氯胺酮是非竞争性N－甲基－D－天门冬氨酸（N－methyl－D－aspartic acid，NMDA）受体拮抗剂，能触发过量的谷氨酸盐，继而兴奋大脑皮质出现精神病样行为和认知异常改变，前额叶皮质（prefrontal cortex，PFC）和边缘系统结构的神经元异常活化，谷氨酸和多巴胺（dopamine，DA）水平的提高是此效应的基础［1］。药物成瘾是一种慢性脑病，针灸具有神经调节作用，针灸疗法具有简便、安全、价廉等特点，被广泛用于临床，在戒毒方面，针灸也取得一定的疗效［2］。针灸疗效有明显的时辰差异性，午时和酉时电针可明显抑制氯胺酮成瘾引起的伏隔核（nucleus accumbens，NAc）酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）表达的增强，通过抑制NAc内DA神经元的活动改善氯胺酮成瘾［3］。有研究表明NAc与内侧前额叶皮质（medial prefrontal cortex，mPFC）是苯丙胺条件位置偏爱恢复的重要解剖学结构［4］。不同时辰电针对氯胺酮成瘾大鼠mPFC内TH的表达的影响如何尚未见报道，本实验对此进行观察研究，进一步探讨针刺对药物成瘾的可能作用机制。

材料和方法

1.动物与分组

雄性SD大鼠56只，体重220±20g，清洁级，由浙江省实验动物中心提供，合格证号：SCXK（浙）2008－0033，保持室温21－25℃，相对湿度60%－65%，自然光照，自由进水，给药前禁食12h。颗粒饲料由皖南医学院动物中心提供。将大鼠随机分为正常对照组、生理盐水对照组、模型组、电针治疗组，电针治疗组再分为子时（23：00）、卯时（5：00）、午时（11：00）、酉时（17：00）4个电针组，每组8只。实验前适应性喂养1w，给药前禁食12h。

2.主要试剂及仪器

盐酸氯胺酮注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号KH090704，规格100mg／2ml），TH一抗（Sigma公司），SABC试剂盒（博士德公司），DAB显色试剂盒；低频电子脉冲治疗仪（型号G6805－2，上海医用电子仪器厂理疗分厂），黑马病理图像分析仪（型号Hema GSM－2000P，产地：深圳）。

3.造模方法

模型组大鼠经腹腔注射浓度为50mg／ml的盐酸氯胺酮注射液，每天1次，连续7d，注射剂量为100 mg／kg，生理盐水对照组大鼠经腹腔注射生理盐水（同模型组注射量），每天1次，连续7d。第一次给药后大鼠表现出呼吸加快、呼吸道分泌物增多，随后出现活动增多、尾巴僵直上翘的兴奋症状，随着用药次数的增多，兴奋症状明显增多，表现为扭体、站立、跳跃、转圈、四脚朝天等。出现上述症状大鼠作为造模成功大鼠，再分为模型组及四个时辰电针组用于实验研究。

4.针刺方法

电针治疗组于给药1w后开始，分别在子时、卯时、午时、酉时给予低频（2 Hz）电针交替针刺“足三里”与“三阴交”穴（其中第1d同时刺激左侧“足三里”与“三阴交”穴，第2d同时针刺右侧“足三里”与“三阴交”穴，如此交替），持续30min，强度3V，波宽1ms，每天1次，连续1w。电针时以大鼠后趾轻微抖动为度，无剧烈挣扎、嘶叫。实验过程中对动物的处置符合有关善待实验动物的规定。

5.行为学观察、评分

在电针治疗结束后（即实验第14d），参照参考文献［5］对多组每只大鼠观察20min。记录每只大鼠扭体、站立、跳跃、转圈、四脚朝天等的次数并进行评分，出现1次症状记为1分，无症状的记为0分，对每只大鼠的各项评分进行统计。

6.免疫组织化学方法

实验完成后，大鼠用30mg／kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，暴露心脏，经左心室－升主动脉插管灌注固定。先快速灌注温生理盐水100ml，再灌注4℃的1%多聚甲醛磷酸缓冲液300ml，30min内灌注完毕。取脑，后固定于4%甲醛固定液中，6h后，入梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋。连续切片，片厚5μm，切片分两组收集。切片常规脱蜡至水，3%H2O2去除内源性过氧化物酶5－10min，95℃－98℃电炉热修复，断电两次，5%正常羊血清封闭，置37℃温箱1h之后滴加抗TH抗体（稀释比例为1∶1000），置湿盒内4℃过夜。第2天37℃温箱复温1h，滴加相应的生物素化的二抗，置37℃温箱2h，滴加辣根过氧化酶标记的链霉卵白素，置37℃温箱1h，DAB－H2O2显色10－30 min。各步骤间均用0.02mol／L PBS（p H7.2－7.4）洗5min×3次，阴性对照实验用PBS代替一抗，其余步骤相同，显色之后常规脱水、透明、中性树胶封片，光镜下观察。每组选取相同冠状切面的切片各16张（其中每只选取2张），参照王平宇［6］的大鼠脑读片图谱，利用黑马病理图像分析系统对400倍视野下mPFC相同区域的TH阳性神经元进行计数和细胞平均灰度值的测量。

7.统计学处理

结 果

1.行为学观察及评分结果

4个时辰电针治疗组的大鼠，随着电针天数的增加，午时、酉时电针组大鼠扭体、站立、跳跃、转圈、四脚朝天等兴奋症状也随之减少，电针连续治疗1w后模型组大鼠活动接近对照组大鼠；子时、卯时电针组大鼠的成瘾症状改善不明显。评分结果见表1。

2.免疫组织化学染色结果

各组大鼠mPFC内均可见TH免疫反应阳性神经元，TH免疫反应阳性神经元呈现棕褐色，着色部位主要位于胞浆内，胞核处染色浅或不着色。正常对照组和生理盐水对照组阳性神经元数量较少，分布较稀疏。与对照组相比较，模型组阳性神经元分布较密集，数量显著增多，细胞平均灰度值降低（P＜0.01），说明染色加深。与模型组相比较，子时、卯时电针组阳性神经元数量差异无统计学意义（P＞0.05）；午时、酉时电针组阳性神经元分布较稀疏，数量较模型组显著减少（P＜0.01），细胞平均灰度值升高（P＜0.01），说明染色变浅。见图A、B、C。

表1 多组大鼠第14d行为学评分结果（±s，8只鼠／组）Table 1 The score of behavioral at 14d in groups of rats（±s，8 rats／group）

表1 多组大鼠第14d行为学评分结果（±s，8只鼠／组）Table 1 The score of behavioral at 14d in groups of rats（±s，8 rats／group）

注：与正常对照组相比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01（vs the normal control group）；与模型组相比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01（vs the model group）。

组别（Group）扭体 （Body twisting）站立 （Rearing）跳跃 （Leap）转圈（Circular motion）四脚朝天 （Legs in the air）正常对照组（Normal） 0.00±0.00 2.00±1.20 0.38±0.52 0.00±0.00 0.00±0.00生理盐水对照组（NS） 0.00±0.00 1.50±1.20 0.63±0.52 0.00±0.00 0.00±0.00模型组（Model） 5.25±1.83＊＊ 3.75±1.49＊＊ 2.38±1.06＊＊ 8.00±3.30＊＊ 6.00±1.77＊＊子时电针组（Group of EA at Zi－Shi） 4.88±1.96＊＊ 3.50±1.31＊ 2.00±0.53＊＊ 8.13±2.30＊＊ 5.50±1.60＊＊卯时电针组（Group of EA at Mao－Shi） 4.63±1.06＊＊ 3.00±1.51 1.88±1.13＊＊ 7.88±2.75＊＊ 5.25±3.24＊＊午时电针组（Group of EA at Wu－Shi） 0.00±0.00＃＃ 2.00±1.07＃＃ 0.75±0.89＃＃ 0.00±0.00＃＃ 0.00±0.00＃＃酉时电针组（Group of EA at You－Shi） 0.00±0.00＃＃ 1.75±0.71＃＃ 0.50±0.53＃＃ 0.00±0.00＃＃ 0.00±0.00＃＃

讨 论

既往的研究［7－9］表明药物成瘾是一种具有强迫觅药行为的慢性脑病，大多数药物成瘾时均有中脑腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA）和 NAc的DA释放增加，PFC是中脑边缘多巴胺系统（meolimbic dopamine system，MLDS）的重要组成部分，接收VTA的DA能投射，PFC继而发送谷氨酸能投射到VTA和NAc，调整DA释放到VTA。氯胺酮长期慢性给药大鼠可显著增加中脑DA含量，上调TH的表达，氯胺酮活化中脑DA能神经元可能和调制皮质－皮质下有关结构神经元的谷氨酸水平有关。氯胺酮滥用导致迟发和持久的皮质下有关结构神经元的DA增多，可能与氯胺酮滥用促成的精神状态改变有关。有研究表明mPFC在尼古丁、可卡因等成瘾中起决定性的作用，机制可能与用药增加 mPFC锥体细胞的代谢率、DA的增多有关［10，11］。TH是DA合成的限速酶，TH的表达强弱可间接反应DA含量的多少［3］。本实验TH结果表明氯胺酮可引起mPFC内TH的表达的显著增高，间接表明mPFC内DA的含量增加，进一步提示了氯胺酮可激活MLDS引起VTA内DA神经元DA的合成、释放增加，并通过神经纤维突触传递到mPFC，导致mPFC的DA的含量增加，引起氯胺酮成瘾的精神症状。我室曾研究表明氯胺酮成瘾大鼠海马CA 1区TH表达显著增加［12］。海马、PFC和海马PFC回路均参与工作记忆功能，来自海马的传入纤维与PFC锥体细胞和γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）能中间神经元形成单突触连接，这种连接方式可将mPFC锥体细胞的兴奋状态控制在一定的水平，不至于兴奋过度［13］。本实验结果还提示氯胺酮成瘾可能通过海马PFC回路形成药物成瘾的负性强化记忆，从而对药物成瘾的根治带来一定的困难。

有研究表明低频电针可降低海洛因成瘾动物模型海马DA浓度，改善动物的觅药行为［14］。本实验选择低频（2 Hz）对氯胺酮成瘾大鼠分4个时辰进行针刺 “足三里”和“三阴交”穴治疗7d后，午时、酉时电针组mPFC内TH免疫反应阳性神经元的数量明显减少，成瘾症状得到明显改善。本实验结果提示午时、酉时电针可促使mPFC区神经元DA的合成、释放减少，调节mPFC区的神经元的活动，改善成瘾症状。这可能是电针治疗药物成瘾的机制之一，但这中间通过何种或哪些信号传导通路具体来进行调节还有待进一步研究。同时本实验还观察到子时、卯时电针对氯胺酮成瘾大鼠的成瘾症状的改善及对mPFC内TH的表达的调节不明显。本室曾研究表明午时、酉时低频电针对大鼠与VTA、海马、杏仁核等有纤维联系的隔外侧核生长抑素mRNA阳性神经元的上调最为显著［15］。有研究表明子午流注取穴法在1个周期内子时、卯时、午时和酉时4个时辰点平均电阻值呈现节律性上、下波动，其峰值出现在卯时，谷值出现在酉时，从子时到酉时呈现一种先升高后降低的运行趋势［16］。不同时辰电针对正常大鼠脑内神经递质表达有明显的时辰差异性，提示时间因素可能是影响电针治疗效应的一个重要因素，不同时辰机体机能状态和昼夜节律的变化可能是不同时辰电针具有不同效应的基础。本实验结果表明午时、酉时电针 “足三里”和“三阴交”穴可改善氯胺酮成瘾症状，下调mPFC内TH的表达，也为后续从细胞信号通路的微观层次上进一步研究电针治疗氯胺酮等药物成瘾的分子机制提供了一定的形态学基础。

［1］Yu H，Li Q，Wang D，et al.Mapping the central effects of chronic ketamine administration in an adolescent primate model by functional magnetic resonance imaging（f MRI）.Neurotoxicology，2012，33（1）：70－77

［2］刘宜军，周文华，杨国栋.针灸戒毒的实验研究现状.中国药物滥用防治杂志，2008，14（2）：102－104

［3］吴锋，熊克仁，王丽发.不同时辰电针对氯胺酮成瘾大鼠伏隔核酪氨酸羟化酶及c－fos表达的影响.针刺研究，2012，37（2）：119－124

［4］Chiang CY，Cherng CG，Lai YT，et al.Medial prefrontal cortex and nucleus accumbens core are involved in retrieval of the methamphetamine－associated memory.Behav Brain Res，2009，197（1）：24－30

［5］蔡军，张勇，吴伟等.吗啡吸入成瘾大鼠模型的建立.解剖学研究，2008，30（4）：297－299

［6］王平宇，张凤真.大鼠脑读片提要及图谱.西安：西北大学出版社，1995：81

［7］Shahidani S，Reisi P，Naghdi N，et al.Lesion of medial prefrontal cortex reduces morphine－induced extracellular dopamine level in the ventral tegmental area：a microdialysis study in rats.Pharmacol Biochem Behav，2012，102（1）：77－81

［8］Tan S，Lam WP，Wai MS，et al.Chronic ketamine administration modulates midbrain dopamine system in mice.PLoS One，2012，7（8）：e43947

［9］Moghaddam B，Adams B，Verma A，et al.Activation of glutamatergic neurotransmission by ketamine：a novel step in the pathway from NMDA receptor blockade to dopaminergic and cognitive disruptions associated with the prefrontal cortex.The Journal of neuroscience，1997，17（8）：2921－2927

［10］Zhang D，Gao M，Xu D，et al.Impact of Prefrontal Cortex in Nicotine－Induced Excitation of Ventral Tegmental Area Dopamine Neurons in Anesthetized Rats.J Neurosci，2012，32（36）：12366－12375

［11］Pum M，Carey RJ，Huston JP，et al.Dissociating effects of cocaine and d－amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal，entorhinal，and prefrontal cortex of freely moving rats.Psychopharmacology，2007，193（3）：375－390

［12］王丽发，徐臣利，熊克仁.电针对氯胺酮成瘾大鼠海马CA1区酪氨酸羟化酶、c－fos表达的影响.针刺研究，2011，36（1）：23－27

［13］王功伍，蔡景霞.海马－前额叶神经回路与工作记忆.动物学研究，2010，31（1）：50－56

［14］陈洪沛，吴俊梅，李彤等.低频电针对海洛因心理依赖小鼠海马乙酰胆碱和多巴胺浓度的影响.成都中医药大学学报，2008，31（2）：29－32

［15］李怀斌，熊克仁，赵健等.不同时辰和频率电针对大鼠隔外侧核生长抑素mRNA阳性神经元的影响。针刺研究，2004，29（4）：266－269

［16］杨玥，周桂桐.子午流注各取穴法穴位电阻值对比分析.中国针灸，2011，8（31）：715－718