免疫组化染色阳性对照的设立、制作与应用

刘 妮 李淑华 梁英杰 杨诗聪

（中山大学附属第一人民医院病理科 广州510080）

免疫组化技术在病理诊断中起着十分重要的作用，但前提是要有稳定和高质量的免疫染色结果［1］。然而免疫组化的染色过程比较复杂，影响染色结果的因素也很多［2］，所以设置免疫组化对照尤为重要。本实验研究在多种不同类型的组织中找出合适的免疫组化阳性对照及其相关制作方法。

材料和方法

1.材料

选取中山大学附属第一医院送检的阑尾、乳腺和扁桃体组织，10%中性甲醛固定，常规脱水石蜡包埋，切片厚4μm。

2.方法

选取的组织通过HE染色观察，根据合适相应抗原表达的区域，将各组织切成0.3cm×0.3cm大小进行再包埋，保证各组织包埋面含有相应的组织成分，如阑尾组织应含有粘膜层，粘膜下层，肌层和外膜等结构。将阑尾、乳腺和扁桃体组织分成A、B、C三组，分别进行36种抗体的全自动免疫组化染色，其中标记上皮相关抗原的抗体有CK、CK8／18、CK19、CK20、CK－LMW、M－CEA、EMA，标记肌源性抗原的抗体有SMA、HHF35、Calponin，标记神经来源的抗体有 Vimentin、S－100、NSE、CD56，标记血管及淋巴管内皮的抗体有 CD31、CD34、D2－40、FactorⅧ，淋巴瘤相关抗体有LCA、CD20、CD79a、CD3、CD5、CD10、CD21、CD23、CD4、CD8，乳腺癌标记相关抗体有ER、PR、Ki67，组织细胞来源相关抗体有CD68，Mac387，AAT，AACT，Lyosozyme。

结 果

A组：阑尾组织中 CK、CK8／18、CK19、CK20、CK－LMW、M－CEA、EMA在腺上皮胞浆呈阳性（图1）；SMA、HHF35、Calponin显示为肌层肌纤维胞浆阳性（图2）；Vimentin显示为间叶组织胞浆阳性；S－100、NSE、CD56为肌层神经纤维阳性（图3）；CD31、CD34粘膜下层血管内皮阳性；D2－40、FactorⅧ为淋巴管内皮阳性；LCA、CD20、CD79a、CD10淋巴细胞阳性，CD21、CD23在固有层的淋巴小结滤泡生发中心的树突状细胞胞膜呈阳性；CD3、CD4、CD5、CD8则在滤泡周围的淋巴细胞呈阳性表达（图4）。CD68、Mac387、Lyosozyme、AAT、AACT在粘膜下层散在的组织细胞胞浆阳性；Ki67在淋巴小结滤泡中心显示为细胞核阳性。共34种抗体染色阳性。

图1 CK腺上皮胞浆阳性10×图2 Calponin平滑肌纤维胞浆阳性10×图3 S－100神经纤维胞浆阳性10×图4 CD3滤泡周围淋巴细胞胞膜阳性20×图5 免疫组化染色片Fig.1 Glandular epithelial cells show positive staining of CK in the cytoplasm.10×Fig.2 Smooth muscle fibers show positive staining of Calponin in the cytoplasm.10×Fig.3 Nerve fibers show positive staining of S－100 in the cytoplasm.10×Fig.4 Follicular peripheral lymphocytes show positive staining of CD3 in the cytomembrane.20×Fig.5 The slide of immunohistochemical staining

B组：乳腺组织中 CK、CK8／18、CK19、CK20、CK－LMW、EMA 在 导 管 上 皮 呈 阳 性；SMA、HHF35、Calponin显示为肌上皮细胞和平滑肌纤维阳性；Vimentin显示为间叶组织胞浆阳性；CD31、CD34血管内皮阳性；D2－40、FactorⅧ淋巴管内皮阳性；ER、PR、Ki67在导管上皮细胞核阳性，其余为阴性染色。共17种抗体染色阳性。

C组：扁桃体组织中CK、CK8／18、EMA在上皮细胞胞浆呈阳性；血管肌层阳性的有SMA、H HF35、Calponin，Vimentin显示为间叶组织胞浆阳性，CD31、CD34血管内皮阳性；D2－40、FactorⅧ淋巴管内皮阳性，LCA、CD20、CD79a、CD10、CD21、CD23在淋巴结滤泡生发中心显示为淋巴细胞胞膜阳性；CD3、CD4、CD5、CD8在滤泡周围副皮质区淋巴细胞呈阳性表达。共21种抗体染色阳性。

讨 论

免疫组织化学技术在病理诊断中是把双刃剑，高质量的免疫组化染色结果能辅助病理医生更准确地进行病理诊断，提过病理诊断水平；但不当的免疫组化染色结果可能会引起漏诊和误诊甚至造成错误的病理诊断，而免疫组织化学染色过程中，经过多个步骤的操作，每一个步骤操作不当都会影响染色结果进而影响病理诊断的准确性［3］。特别是全自动免疫组化机越来越普及，在使用全自动免疫组化染色机染色时，无从观察到染色的全过程，如果出现切片上抗体量不足或有气泡等现象也无法避免。因此，进行免疫组化染色质控，确保染色结果稳定可靠十分重要。在染色过程中设立对照是进行染色质控的重要措施之一，能保证免疫染色过程中抗体试剂可靠，染色操作正确，避免试剂失效，操作失当或机器故障引起假阳性或假阴性的结果。对照组织一般预先切片贴在载玻片中央保存，需要时再将待检测组织切片贴在对照组织旁边（图5），使待检测试组织片和对照片都在同一张玻片中，在相同的条件下，进行免疫组化染色。在观察染色结果时，应首先观察对照组织片的染色结果，通过对照片的结果来判断该片免疫组化染色是否成功。如果对照片染色结果抗原表达正确，没有非特异性染色，则该片中待检测组织的染色结果就可靠，可用于病理诊断.如果对照片染色不当，出现非特异性染色，那么该待检组织片就不能用于诊断，需要找出染色不当的原因，重新进行染色。

目前，国内外很多单位多使用组织芯片作为对照［4，5］。但组织芯片中有多个组织才能满足几十种抗体对照的需要，所占的面积较大，所需的抗体也较多，而且制作组织芯片麻烦，也经常出现某一个组织掉片的现象，购买商品化的组织芯片成本高［6］。本实验选取阑尾组织作为对照组织，较其他组织阑尾组织所包含的组织细胞种类多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管等，大部分常用的抗体都分别在相应的组织细胞中表达或不表达，因此最适合用于制作免疫染色的对照片。而且阑尾作为阳性对照的制作方法也比较简便，正常阑尾管腔小，只需将呈管状组织的阑尾组织，沿管径切成0.3cm×0.3cm大小的扇形阑尾，使其含有粘膜层、粘膜下层、肌层和外膜，保证组织含有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管等组织细胞，再包埋成0.4cm×0.4cm大小的组织蜡块。这样制作对照片，标本来源容易，制作简单，可节约人力、物力，也十分适合基层医院开展工作。

用作对照的组织蜡块和石蜡切片，不适宜长期保存，因存放时间过长，组织抗原的保存受到一定的影响，抗原活性会有所降低，因此组织蜡块保存于数月后应放弃使用，重新找新的组织制作蜡块，而阑尾组织较容易获得，材料来源十分方便。另外切好的对照片一般在室温晾干过夜，此时，组织蜡片没有熔开，可保存长一些时间，待贴上待检测组织片时，再一起烤片。切片的数量按平时的工作量作为依据，一般可供使用一星期为佳，不宜大量切片，过长时间保存。阑尾组织作为对照组织也有一定局限性，对于某些抗体染色，阑尾组织并都不适用，需要另外选取相应的对照组织片，如ER、PR等抗体染色的阳性对照，则应选用含正常导管上皮的乳腺导管癌组织片做对照。

综所上述，我们认为阑尾组织较其他单一组织，可用于更多种抗原的染色对照，较组织芯片制作更简单，操作更方便，成本更低，所耗费的试剂更少，因此最适合用来制作免疫组化染色的质控对照片，值得推广使用。

［1］李丽华，病理免疫组化染色方法质量控制应注意的问题.局解手术学杂志，2008，（06）：434－435

［2］李德本，王涛，姜骏.免疫组化染色的操作技巧和注意事项.临床与实验病理学杂志，2011，（11）：1260－1261

［3］梁英杰，凌启波，张威.临床病理学技术.北京：人民卫生出版社.2011：292

［4］刘卫平等，组织芯片技术及其在病理学研究中的初步应用.中华病理学杂志，2002，（02）：83－84

［5］Sallinen SL.Identification of differentially expressedgenes in human gliomas by DNA microarray and tissue chip techniques.Cancer Res，2000，60（23）：6617－6622

［6］景青萍，张建中，郑燕华，等.微组织芯片在免疫组化染色对照实验中的应用.诊断病理学杂志，2005，（02）：154－155