利用甲醛固定的陈旧组织制作常规HE切片方法探讨

瞿智玲 倪 娟 陈多恩 王 曦 王国平

（华中科技大学同济医学院附属同济医院病理研究所，武汉430030）

组织经甲醛长期固定后，组织细胞的着色力明显下降，而且由于甲醛的挥发效应，随着时间的推移，固定液中实际甲醛的浓度逐渐降低，甚至远远低于常规固定时要求的4%的浓度，因而细胞形态出现异常。此外，由于甲醛在空气中被氧化成甲酸，导致甲醛固定液呈酸性，组织长期处于酸性环境下，影响其着色，本文的目的在于探讨经甲醛长期浸泡后的组织制作常规HE切片的染色方法。

材料和方法

1.材料

4%甲醛固定二十余年的亚急性重型肝炎病变之肝脏；碳酸氢钠；FFA固定液。

2.试剂配制

2.1 5.6%碳酸氢钠

称取56g碳酸氢钠，溶于1000ml蒸馏水中，充分溶解备用。

2.2 FFA固定液

市售甲醛液10ml、冰醋酸5ml及95%酒精85ml室温混匀。

3.实验分组及染色方法

取肝脏同一切面上多块组织，编号后分别做不同处理。实验分组如下：

A组：将组织行常规脱水处理，制作切片（切片厚度4μm），常规脱蜡染色。

B组：将组织行常规脱水处理，制作切片（切片厚度4μm），脱蜡后，浸入5.6%碳酸氢钠溶液过夜，充分水洗，常规HE染色。

C组：将组织浸入5.6%碳酸氢钠处理24h后取出，流水冲洗，FFA固定液固定4－6h，常规脱水处理，制作切片，常规脱蜡染色。

D组：将组织浸入5.6%碳酸氢钠处理48h后取出，流水冲洗，FFA固定液固定4－6h，常规脱水处理，制作切片，常规脱蜡染色。

E组：将组织浸入5.6%碳酸氢钠处理24h后取出，流水冲洗，FFA固定液固定4－6h，常规脱水处理，制作切片，脱蜡后，再浸入5.6%碳酸氢钠溶液过夜，充分水洗，常规HE染色。

F组：将组织浸入5.6%碳酸氢钠处理48h后取出，流水冲洗，FFA固定液固定4－6h，常规脱水处理，制作切片，脱蜡后，浸入5.6%碳酸氢钠溶液过夜，充分水洗，常规HE染色。

结 果

A组组织和切片未经任何特殊处理，细胞着色不理想，肝细胞形状偏肥大（图1）。B组组织未经任何特殊处理，切片脱蜡后经5.6%碳酸氢钠处理过夜，细胞着色有所改善，但仍不理想，且肝细胞形状仍偏肥大（图2）。

C组和D组组织经5.6%碳酸氢钠分别处理24和48h后，再用FFA固定后制作切片，肝细胞形状趋于正常大小，着色有所改善（图3和4）。

E组和F组组织经5.6%碳酸氢钠分别处理24h和48h后，再用FFA固定，制作的切片再经5.6%碳酸氢钠浸泡过夜，结果显示肝细胞形状基本正常，着色明显改善（图5和6）。

综上所述，组织经FFA处理后，肝细胞形态异常得到改善，趋于正常大小。切片经5.6%碳酸氢钠处理后，随碳酸氢钠的处理时间延长，细胞着色达到明显改善。

图1 A组，未经任何特殊处理的肝脏组织。×200图2 B组，仅切片经5.6%碳酸氢钠处理过夜的肝脏组织。×200图3 C组，组织经5.6%碳酸氢钠浸泡24h，切片未作任何特殊处理的肝脏组织。×200图4 D组，组织经5.6%碳酸氢钠浸泡48h，切片未作任何特殊处理的肝脏组织。×200图5 E组，组织经5.6%碳酸氢钠浸泡24h，切片也经5.6%碳酸氢钠 过夜处理的肝脏组织。×200图6 F组，组织经5.6%碳酸氢钠浸泡48h，切片也经5.6%碳酸氢钠 过夜处理的肝脏组织。×200Fig.1 Group A，Liver tissue without any treatment×200Fig.2 Group B，only setions treated with 5.6%Na HCO3 overnight×200Fig.3 Group C，only liver tissue treated with 5.6%Na HCO3 for 24h×200Fig.4 Group D，only liver tissue treated with 5.6%Na HCO3 for 48h×200Fig.5 Group E，tissue and sections treated with 5.6%Na HCO3 for 24 h and overnight respectively×200Fig.6 Group F，tissue and sections treated with 5.6%Na HCO3 for 48h and overnight respectively×200

讨 论

组织切片由于各种原因，或者组织放置过久，或者切片保存不善，导致制作常规HE切片时着色不好。笔者曾将褪色的HE切片恢复颜色［2］，获得较好的效果。在尝试本实验初，笔者采用此法，结果染色效果不佳。分析原因，发现褪色切片因组织一次处理到位，组织本身不存在着色问题，所作的只需加强染色效果即可。而本实验中因整个肝组织浸泡于甲醛液中，本身固定不彻底，再加上浸泡的时间过久，长达三十年，甲醛被氧化成甲酸，造成固定液由中性变成酸性，致使按常规方法制作HE切片效果不佳。

本文采取5.6%碳酸氢钠处理组织和切片，碳酸氢钠可以中和甲醛被氧化后产生的甲酸的酸性作用，调节组织的p H值，使组织细胞处于能较好着色的环境中［1］。用FFA固定液再次固定组织及切片，该固定液中冰醋酸对细胞具有收缩作用，使经酸性甲醛浸泡后变肥大的细胞在形态上趋于正常大小。结果显示，上述设想达到预期效果，细胞形态、大小和着色均得到改善。

［1］王伯沄，李玉松，黄高昇等.病理学技术.北京：人民卫生出版社，2000；117－121

［2］瞿智玲，倪娟，敖启林等.陈旧褪色病理教学HE切片颜色恢复技术探讨.临床与实验病理学杂志，2011，27（4）：433－434