Raf激酶抑制蛋白的研究进展

陈礼升 钱 康 田 波

（华中科技大学同济医学院基础医学院神经生物学系，武汉430030）

Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitory protein，RKIP）是磷脂酰乙醇胺结合蛋白（Phosphatidylethanolamine－binding protein，PEBP）超家族的一个成员。1984年Bernier等［1］首先在牛脑里发现了PEBP－1蛋白，后来 Banfield等［2］又从老鼠的精子中分离出该种蛋白。PEBP是一类高度保守的小分子蛋白，和目前已知的其他蛋白没有同源性。2002年，Hickox等［3］将哺乳动物细胞中的PEBPs成员分成三个亚类：PEBP－1、PEBP－2和PEBP－3，而RKIP属于 PEBP－1 ENREF 1。Wang等［4］最近又在人骨髓间质细胞里发现了一个新的PEBP成员，并将其命名为h PEBP4。1999年Yeung等［5］用酵母双杂交筛选法纯化出PEBP－1，同时证明其能通过结合Raf－1阻止 MEK磷酸化，进而抑制Raf－1／MEK／ERK信号通路，因此把PEBP－1重新命名为RKIP ENREF 3。这次研究对RKIP来说是里程碑式的，它首次阐述了RKIP在信号通路上的作用。此后人们对RKIP的研究越来越多，发现其还参与G蛋白偶联受体信号通路［6］和NF－κB信号通路的调控［7］。

RKIP的物种分布非常广泛，从酵母、植物和动物等真核生物到细菌这样的原核生物都能发现同源蛋白［8］。RKIP的组织分布同样广泛，人、猴、牛、老鼠等哺乳动物和鸡的大部分组织都有表达［9］，且在睾丸、大脑胶质细胞和海马中的含量最高［10，11］。虽然很多内分泌器官表达RKIP，但在前列腺、精囊和子宫的分泌液以及乳汁、血液、唾液中没有发现其存在［12］。最 近，Zhang 等［13］研 究 人 和 小 鼠 胰 腺 的RKIP，发现其仅在胰岛表达，在腺泡和导管细胞不表达。免疫组织化学分析显示，RKIP主要分布在组织的细胞质及质膜上［14］。Vallee等［15］研究发现，RKIP是通过静电作用的方式与带负电荷的膜结合从而定位到质膜上的，而不是通过与膜上的磷脂酰乙醇胺直接作用。

近年来，由于能影响细胞内信号转导、调控细胞周期、抑制肿瘤转移以及在神经退行性疾病、生殖系统、情绪调整中的作用，人们越来越认识到RKIP的重要性，对其研究也越来越多。本文主要介绍RKIP的生物学功能，着重于其在神经系统、肿瘤和生殖系统中的研究进展。

1.RKIP的基因表达及蛋白结构

RKIP基因家族在生物进化中高度保守，相隔很远的物种都能找到同源蛋白质。人除了有RKIP－1表达外，还存在有h PEBP4。老鼠则表达三种RKIP基因：RKIP－1全身广泛表达；RKIP－2局限于睾丸［3，16］；mRKIP－4位于老鼠的19号染色体，主要表达在视网膜［17］。人RKIP基因定位于12号染色体q24.23［14，18］，长约10 000bp，含4个外显子，其转录的 mRNA长达1434bp［19］。人 RKIP的 mRNA跟牛的有95%相似性，跟老鼠的则有85.5%相似性［10］。人RKIP是187个氨基酸组成的23k Da蛋白质，与牛21k Da的RKIP有186个氨基酸重叠，与老鼠23k Da的 RKIP有187个氨基酸重叠［19］。RKIP能被结晶成两种不对称的蛋白分子，这两种蛋白的关系目前还不清楚。用凝胶电泳和荧光技术还发现有RKIP二聚体存在［2］。后来的研究显示磷酸化RKIP会导致二聚体产生，并且是RKIP与Raf－1解离后结合到GRK2上的一个关键步骤［20］。晶体结构研究表明，RKIP是由9个β折叠和4个α螺旋组成的稳定结构。对所有的PEBP蛋白家族进行基因序列分析，发现其中间的序列高度保守，而N端和C端序列变异性较大［21］。PEBP中间就都存在一个保守的拓扑结构，由中央一个大的β折叠两侧分别连着一个小的β折叠和两个C端α螺旋构成［22］。RKIP也含这样的保守结构域作为配体结合袋，对调节多种底物包括核苷酸（GTP和GDP）、黄素单核苷酸（Flavin mononucleotide，FMN）、磷脂和非脂类化 合 物 结 合 RKIP 有 重 要 作 用［2，15，23－25］。 结构分析显示，RKIP的配体结合袋很窄浅，接近蛋白分子的表面，只能容纳磷脂分子的极性端［14］。当RKIP与配体结合时，氢键发生断裂，分子构象改变，游离的N端自由度变大，易被裂解成海马胆碱能神经元刺激肽（Hippocampal cholinergic neurostimulatingpeptide，HCNP）［26］。

2.RKIP与信号转导通路

2.1 Ras／Raf－1／MEK／ERK信号转导通路

Yeung等的体外研究实验表明，RKIP能与Raf－1、MEK－1及 ERK－2结合，但结合 ERK－2的作用较弱，从而抑制Raf－1介导的 MEK磷酸化和Ras／Raf－1／MEK／ERK 信号通路［5］。RKIP不能同时结合Raf－1和MEK，因为各自与它们结合的位点有部分重叠［27］。RKIP不是Raf－1的直接底物也不能与Ras结合。我们知道Raf－1最重要的磷酸化位点是338位的丝氨酸以及340和341位的酪氨酸。已经有研究证明PAK （P21－activated kinase）能磷酸化Raf－1第338位的丝氨酸，而Src家族激酶能磷酸化Raf－1的第340和341位的酪氨酸。突变Raf－1这些位点为模拟磷酸化的天冬氨酸，RKIP对MAPK通路就没有影响。Trakul等［28，29］发现，虽然可以与Raf－1和MEK－1结合，但RKIP是通过封闭PAK与Src家族激酶磷酸化Raf－1激酶的功能区，而不是通过破坏Raf－1和 MEK间的相互作用来抑制MAPK通路。RKIP缺失并不影响细胞信号通路的存在与否，但是会让细胞对EGF等外界刺激变得更加敏感。

虽然RKIP也能与B－Raf相互作用，但B－Raf相当于Raf－1 Tyr341的位点已经被磷酸化的氨基酸取代了，因此RKIP的表达水平被下调后并不影响B－Raf的激活［28］。这说明RKIP主要通过调节Raf－1的活性而不是B－Raf的活性来影响MAPK信号。研究还表明，蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）可以磷酸化RKIP第153位丝氨酸，致使其失去与Raf－1结合的能力。同时PKC与RKIP在质膜上位置靠近，这些都表明PKC可以与RKIP相互作用，从而在细胞信号传导中发挥作用［30］。

2.2 G蛋白偶联受体信号转导通路

GRK－2（G protein coupled receptor kinase－2）是G蛋白偶联受体（G protein coupled recepters，GPCR）主 要 的 负 反 馈 抑 制 因 子［31］。GPCR 被GRK－2磷酸化后，与G蛋白脱离进而内化，最终导致G蛋白信号失活。有研究表明RKIP是GRK－2的生理抑制因子，能够结合GRK－2的N端结构域，从而抑制GPCR磷酸化。RKIP不影响其它能磷酸化 GRCP的蛋白激酶如 GRK－5、PKA 和 PKCα等［6］。Kroslak等［32］研究证明，RKIP能增强 G 蛋白信号转导。突变RKIP的Ser153为不可磷酸化的氨基酸，结果RKIP失去了与GRK－2的结合能力，表明磷酸化的RKIP才能与GRK－2结合。当GPCR受到刺激后，会激活PKC导致RKIP的Ser153磷酸化。磷酸化的RKIP与Raf－1脱离，转而结合GRK－2［6］。最新研究显示RKIP的二聚化在其从Raf－1转换结合到GRK－2的过程中发挥重要作用。Ser153磷酸化的RKIP极易变成二聚体，并且RKIP二聚体高亲和GRK－2但低亲和Raf－1［20］。因此RKIP的磷酸化同时调节了两条信号通路：⑴结合抑制了GRK－2从而增强了GPCR信号通路；⑵通过与Raf－1分离，激活了 MAPK信号通路。RKIP在Raf－1和GRK－2之间的这种交叉作用揭示了一种新的信号调节机制，这对维持促生长的Raf－1信号通路和抑生长的GRK－2信号通路间的平衡起着重要作用［6］。

2.3 NF－κB信号转导通路

NF－κB是由REL转录因子家族成员组成的同源或异源二聚体，能上调大量蛋白参与多种重要的生物学活动，如免疫反应、炎症、以及细胞增殖凋亡等。在无刺激状态下，NF－κB与抑制因子IκB结合，以无活性的复合物形式存在于细胞浆中，阻止核转录作用的发生。受到刺激后，IκB会被IKK（IκB kinase）复合物磷酸化，随后泛素化，最终被蛋白酶体降解。NF－κB因此被释放出来并转位到细胞核内［33］。Jazirehi等［34］发现用利妥昔单抗可以提高非霍奇金淋巴瘤中RKIP的表达从而抑制NF－κB途径，使抗凋亡基因的表达降低。研究表明过表达RKIP可抑制 TNF－α或者IL－1β诱导的 NF－κB 信号转导，低表达RKIP则有相反作用，并且这种作用独立于RKIP对 MAPK信号通路的影响［7］。进一步研究证实，RKIP能和IKK复合物自身及上游因子如IKKα（IκB kinaseα）、IKKβ（IκB kinaseβ）、NIK（NF－κB inducing kinase）、TAK1（TGF－βactivated kinase 1）以及泛素连接酶TARF6相互作用［35］。基因敲除 RKIP后，TAK1、TRAF6和IKK复合物泛素化或磷酸化减少。有趣的是RKIP表达无论增加和减少都会导致IκB磷酸化和降解减少。这些表明RKIP可能是一种支架蛋白，促进IKK复合物的组装。RKIP表达下调会提高NF－κB靶基因的基底表达水平，而这似乎与IκB降解减少不一致。研究发现RKIP基因敲除细胞会相应的下调NF－κB信号通路的负反馈调节因子IκB、A20和Cyld表达。这提示RKIP抑制NF－κB信号通路是通过增加负反馈调节因子表达来实现的［35］。

3.RKIP在神经系统中的作用

3.1 RKIP与阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）的发病机制复杂，主要有β淀粉样蛋白级联学说、中枢胆碱能损伤学说、兴奋性氨基酸毒性学说和Tau蛋白学说。也有报道认为其他因素如炎症和免疫功能异常、自由基和氧化应激作用、胰岛素相关糖代谢异常、钙稳态失调、脂质代谢异常等与AD的发生有关，但这些病理生理机制尚待进一步阐明。在迟发型AD患者的大脑中，我们发现了RKIP的mRNA水平严重下降［36］。HCNP是RKIP N端2－12位氨基酸残基的裂解物［26］，HCNP和神经生长因子（Nerve growth factor，NGF）一起维持脑内胆碱乙酰转移酶（Choline acetyltransferase，Ch AT）高水平，而高水平Ch AT对海马内侧隔核的发育非常重要［37］。RKIP低表达会相应的造成Ch AT水平下降，导致与年龄相关的记忆力减退，这正是AD的特征症状之一。研究还发现海马CA1区的Hirano小体大量积聚和强表达 HCNP［38，39］。Hirano小体为神经细胞树突近端棒形嗜酸性包涵体，大量出现在老年性AD病人中［38］。它能够扰乱海马胆碱能神经系统，从而影响人的学习和记忆。在AD早期病人的脑脊液中也检测到了高剂量的HCNP［40］。现在还不清楚RKIP或者HCNP在神经系统以及AD中的具体作用机制。

在APP过表达的AD Tg2576小鼠模型中，George等［41］发现了Aβ斑的形成与海马区RKIP水平下降高度相关。通过敲除小鼠RKIP基因，发现RKIP在边缘系统包括嗅核，海马，杏仁核等中广泛表达。同时还发现四个月大的RKIP－／－小鼠在嗅觉和学习方面比同龄的正常小鼠差［16］，而嗅觉下降也是AD的特征表现。研究认为RKIP可能通过调节 GRCP信号传导通路来影响嗅觉［6，42］。

种种迹象表明，RKIP及其产物HCNP在AD的病理过程中具有重要作用。

3.2 RKIP神经系统中的其他作用

RKIP在神经元分化中起着重要作用。分别建立RKIP过表达和下调的神经母细胞瘤细胞系，结果发现RKIP过表达的神经母细胞瘤向神经元方向分化，而通过sh RNA干扰技术使RKIP下调的神经母细胞瘤向胶质细胞方向分化。RKIP使神经母细胞瘤向神经元方向分化的机制主要是增强了PKC－ERK1／2和 GPCR信号传导通路［43］。

视交叉上核（Suprachiasmatic nucleus，SCN）是哺乳动物昼夜节律调节系统的中枢结构，产生和调节睡眠－觉醒、激素、代谢和生殖等众多生物节律和功能。SCN的结构和功能改变被认为是生物节律紊乱的神经生物学基础。SCN的昼夜节律性除了受到自身生理和行为调节外，还被大量外界环境因素比如光等影响。光信息通过视网膜下丘脑束从视网膜传送到视交叉上核后，SCN神经元激活一系列胞内信号通路来调节生物节律。其中最重要的信号通路是p44／p42 MAPK／ERK，是光调节昼夜节律性的先决条件［44］。研究发现光能使小鼠SCN的RKIP磷酸化并与Raf解离。在基因突变RKIP使其不可磷酸化的小鼠中，SCN没有表现出光诱导的ERK1／2激活或者生物节律的改变。相反的在RKIP基因敲除小鼠中，SCN的ERK1／2活性对光刺激反应增强并且加强了光对生物节律的调节。研究表明了RKIP在光调节SCN生物昼夜节律性中的重要作用［45］。

长时程抑制（Long－term depression，LTD）是突触可塑性的重要形式之一，并且与学习记忆存在着密切的关系。已经有人证明了PKC依赖的MAPK信号通路在小脑LTD中的重要作用，并且其主要受磷脂酶A2调节。最近研究发现RKIP也可以参与调节PKC对MAPK信号通路的作用，主要是因为RKIP能抑制 MAPK的上游分子 Raf－1和MEK。把不可被PKC磷酸化的RKIP突变基因通过膜片钳电极导入小鼠小脑切片的浦肯野细胞中，LTD被阻断，野生型的RKIP则对LTD没有影响。同时生化分析发现，在PKC依赖途径诱导LTD时，内源性的RKIP会与Raf－1和MEK分离。从中可以得出，RKIP抑制诱导小脑LTD的PKC依赖途径［46］。

4.RKIP在肿瘤中的作用

4.1 RKIP在肿瘤转移中的作用

肿瘤转移指肿瘤细胞从原发部位经淋巴道、血管或体腔等途径到达其他部位继续生长，是一个复杂的过程，需要癌细胞和宿主共同作用。能抑制转移过程的基因被称为转移抑制基因（Metastasis suppressor gene，MSG），但它并不抑制原发肿瘤的发生。为了筛查出MSG，有人用mRNA基因芯片检测了两种前列腺癌细胞系LNCaP和C4－2B。结果发现高转移性的C4－2B前列腺癌细胞中的RKIP表达水平与低转移性的LNCaP前列腺癌细胞相比低很多［18］。对小样本量的前列腺癌转移患者进行统计也发现RKIP在转移的前列腺癌细胞中表达下调。这些都提示了RKIP在肿瘤转移中的重要作用。

体外实验显示，RKIP基因敲除的LNCaP细胞其侵袭能力增强。相对应的，RKIP表达恢复的C4－2B细胞其侵袭能力下降。进一步的体内实验发现，将RKIP表达恢复的C4－2B细胞原位注射到小鼠的前列腺后，前列腺癌肺转移率下降，但是原发肿瘤的生长没有受到抑制［18］。通过这个实验，我们认为RKIP是一种转移抑制基因。除了前列腺癌，RKIP还能抑制乳腺癌、黑色素瘤等其它肿瘤的转移［47］。最近还发现RKIP表达下调能提高神经胶质瘤细胞存活率和侵袭力，但是不影响肿瘤细胞的增殖和血管生成［48］。

RKIP抑制肿瘤转移的具体机制还不清楚，可能是负向调节导致肿瘤转移的信号通路。这些肿瘤转移信号通路可以被肿瘤转移基因 MMP1、OPN和CXCR4等激活。转录因子c－myc能使LIN28表达增加，LIN28能结合let－7的前体物质从而减少成熟小 RNA let－7生成。let－7通过减少转录因子BACH1的合成抑制肿瘤转移基因MMP1、OPN和CXCR4转录［49，50］。我们知道 ERK 能激活下 游 分子c－myc，而 RKIP能抑制 Ras／Raf－1／MEK／ERK通路进而抑制上述的肿瘤转移基因转录表达。最近又有研究表明，RKIP能够通过抑制NF－κB信号转导通路从而抑制基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）的表达。基因敲除RKIP的肿瘤细胞MMPs尤其是MMP－1和MMP－2水平明显升高，侵袭性增强。但同时敲除MMPs和RKIP后，肿瘤细胞的侵袭性回归正常［51］。

4.2 RKIP在肿瘤中的非转移作用

RKIP减少除了能增加肿瘤转移，还能提高肿瘤细胞对放射线和化疗药的耐受性［52，53］。目前的研究发现，RKIP表达下调能激活抗氧化应激转录因子 Nrf2，从而减少细胞凋亡［54］。正常情况下Nrf2的Neh2结构域与Keap1的Kelch重复区相互作用，而Keap1与肌动蛋白细丝结合，这就导致Nrf2被控制在胞质中。氧化应激使Keap1泛素化后，Keap1结构改变，Nrf2与之解离。随后Nrf2通过核孔进入核内，与抗氧化反应元件（ARE）相互作用，诱导抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的基因表达，从而在细胞的防御保护中发挥重要作用。近年的研究发现，Nrf2对肿瘤细胞也有保护作用，Nrf2／Keap1／ARE信号通路的下游靶基因，多数已证实与肿瘤的耐药机制相关［55］。RKIP减少会诱导 HEK－293细胞产生强烈的氧化应激反应，而且RKIP能提高结肠直肠癌组织和HT29 CRC细胞系中Keap1的稳定性。在用阿霉素治疗的HT29细胞的过程中还发现了RKIP／Keap1结合物［54］。这都说明RKIP通过Nrf2／Keap1／ARE信号来诱导肿瘤耐药性。

RKIP在良性前列腺组织中表达水平最高，然而随着Gleason评分的增加，其在前列腺细胞中表达水平逐渐减低。有50%原发性前列腺癌的RKIP低表达，它的五年无瘤生存时间只有61%，低于RKIP高表达的88%［47］。虽然RKIP与宫颈癌的临床分期和病理类型没有关联，但是影响宫颈癌的淋巴结转移［56］。大量的研究数据都显示RKIP与肿瘤的预后和复发相关，可以作为肿瘤的生物标记用于临床评估。

5.RKIP与精子发生

精子是一个高度分化的细胞，在生成过程需要进行复杂的细胞重塑。精子发生主要在男性的附睾中，但最后要在女性的生殖道中获能才具备生育能力。RKIP普遍存在于哺乳动物的精子、睾丸和附睾［57］，并在大鼠的生精小管、睾丸间质细胞和精子细胞中高表达［58］，最近发现其在小鼠的生精小管也高表达［3］。研究推测RKIP可能参与精子细胞膜的生物发生和精子的免疫屏障作用，但其在生殖系统中的具体作用机制目前还不清楚［59］。研究发现RKIP基因敲除的成年大鼠在精子发生上与野生型大鼠没有什么区别［57］，说明RKIP在精子发生中不重要。RKIP基因敲除雄鼠与正常雌鼠的生育率下降了90%以上，RKIP基因敲除雄鼠与RKIP过表达雌鼠的生育率也是下降的，但是RKIP过表达雄鼠与RKIP基因敲除雌鼠的生育率没什么影响［57］。这说明了RKIP主要影响雄性的生育能力。

Gibbons等［60］发现RKIP主要影响精子的获能过程。精子只有在女性的生殖道中获能了才具备生育能力，而这个过程涉及精子表面蛋白的丢失。获能是一个可逆的过程，能使精子去获能的物质被称为去获能因子（Decapacitation factors，DFs）。DFs与精子膜表面的特异性受体结合后发挥去获能作用。Gibbons证明RKIP是一种DFs受体，但也有研究说RKIP是DFs。用金霉素进行获能实验，检测附睾尾端的精子获能率，结果RKIP基因敲除老鼠的是90%已获能，相对应的野生型老鼠精子的获能率只有50%［57］。这些都说明了RKIP在生育上的重要性。

6.展望

RKIP被发现已经二十几年了，人们对它的关注也越来越多。目前对RKIP的研究集中在信号转导、细胞周期调控和凋亡、肿瘤转移以及神经系统疾病等方面。RKIP通过调控信号转导通路广泛参与各个系统的病理生理过程，说明了其在人体中的重要性。RKIP在AD、肿瘤和糖尿病等严重威胁人类的疾病中的具体作用还不清楚，但RKIP在某些细胞系中被证实具有抑制细胞生长和肿瘤转移以及促进凋亡等重要功能，且已经被确定为前列腺癌的转移抑制基因。有研究表明Raf抑制剂可以改善神经退行性疾病。这都表明RKIP能为治疗这些疾病提供新的思路和新的靶点，因此对其研究还是非常有必要的。

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