动脉微栓过滤器抗凝涂层修饰及生物相容性研究

陆海滨 李 彤 段大为 高文卿 于美丽 周淑芬 李金友 于广栋

1（天津医科大学研究生院，天津 300203）2（天津市第三中心医院，天津 300170）3（天津市人工细胞重点实验室，天津 300170）

引言

动脉微栓过滤器（arterial filter，AF）是体外循环（extracorporeal circulation，ECC）中用于滤除气栓、脂肪粒等微小栓子的装置，可以降低ECC相关的神经系统认知功能障碍［1］。滤网是AF的核心组件，多由涤纶、锦纶、尼龙等材料制成。

自ECC技术应用于心脏手术以来，炎性反应、滤网堵塞导致的剪切力过大破坏血液成分、循环流量减低、进血端压力过高存在管路迸裂风险等并发症便成为亟待解决的问题。近年来，由于涂层材料的使用，上述与ECC相关的并发症得到显著改善［2－3］。

目前，国内应用的涂层ECC设备均为进口产品，主要应用于ECMO转流，价格昂贵，在常规手术中应用受到限制［4］。而AF涂层单一，产品少，选择空间小。由于结构的特殊性，涂层AF不但要有良好的生物相容性，还要兼顾应用安全等，但国内外鲜有针对AF新型涂层的研究报道。

低分子肝素钠（low molecular weight heparin，LMWH）是目前国外ECC设备中广为应用的一类涂层物质，抗凝效果确切。海藻酸钠是生物相容性良好的天然提取物，造价低廉，是药物载体的理想材料。部分氧化后的海藻酸钠（oxidized sodium alginate，OSA）表面有大量的活性醛基［5］，可以实现与改性后材料的共价结合。LMWH与OSA两种不同涂层的滤网，可以在抗凝效果、材料成本以及扩展应用方面满足不同的要求。

为研究新型涂层材料，将现有国产未涂层的AF产品进行拆解，对其核心组件——涤纶（polyester，PET）材质的滤网进行化学接枝改性，共价结合LMWH涂层和OSA涂层，并对涂层后材料的生物相容性和AF应用安全性进行评价和比较。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

成人动脉微栓过滤器（东莞科威医疗器械有限公司）拆解后，将滤网裁剪为5 cm×2 cm；肝素钠（分子量12 000～20 000，效价150 IU/mg，安徽金鑫生物），人血清白蛋白（Behring GmbH，德国），人血清纤维蛋白原（EMD Chemicals，德国）；聚乙烯亚（分子量60 000）、海藻酸钠（分子量7 000～20 000）、亚硝酸钠、高碘酸钠等试剂均购自Sigma公司。

红外分光光度计（NICOLET 6700，Thermo，美国），紫外分光光度计（UV-2800，日立，日本），凝血自动分析仪（STA-R Evolution®，Diagnostica Stago，法国），血细胞分析仪（ADVIA2120，SIEMENS，德国），BCA蛋白定量试剂盒（SK3021，上海生工），扫描电镜（FEI台式，美国）。

1.2 方法

1.2.1 材料表面改性与涂层制备

1.2.1.1 重氮化方法制备LMWH［6］

肝素钠粉剂1 g充分溶解于去300 mL离子水中，并加入亚硝酸钠10 mg，在0℃、pH=2.7条件下反应2 h后，调定溶液pH值至7.0以中止反应，得到LMWH溶液。用7 000 Da孔径的透析袋将反应后的溶液进行透析后冷冻，利用低温真空干燥机进行干燥获得LMWH粉末。

1.2.1.2 OSA的制备［5］

将海藻酸钠4 g充分溶解于196 g去离子水中，并加入高碘酸钠0.432 g，避光反应24 h，加入乙二醇终止反应，得到OSA溶液。向OSA溶液加入NaCl，混匀后倒入乙醇中，将析出物抽滤干燥后再次溶于去离子水中，用3 500 Da孔径的透析袋进行透析，低温真空干燥后获得OSA粉末。

1.2.1.3 涤纶滤网表面改性与涂层修饰［7］

取200 mL质量分数为30％的H2SO4，并加入0.948 g的K2MnO4，配制K2MnO4浓度为0.03 mol/L的H2SO4·K2MnO4溶液。如图1所示，首先用H2SO4·K2MnO4溶液对PET材料进行预处理，氧化材料表面形成羧基（—COOH，a），充分清洗干燥后，在pH=9、室温条件下与聚乙烯亚胺的氨基（—NH2，b）结合并构建大量的“空间臂”，增加以氨基基团为主的结合位点，进而与LMWH或OSA末端的醛基（—CHO）结合，制成“终点固定”方式的共价键结合的涂层材料：LMWH涂层的PET滤网（LMWH组），OSA涂层的PET滤网（OSA组）。另有空白对照的未涂层滤网（PET组）。

图1 高分子材料表面共价结合涂层的制备流程Fig.1 The flow chart of the coating material production.

1.2.1.4 整装滤器的涂层修饰

整装涂层滤器用于压力、流量测定。将未拆解的AF接入闭合回路，在不同处理阶段，依次预充H2SO4·K2MnO4溶液、PEI溶液、LMWH或OSA溶液，并维持转流状态；在每次更换预充液前、反应结束后，使用去离子水反复冲洗。

1.2.2 材料表面涂层效果分析

1.2.2.1 材料表面涂层定性分析

分别制备LMWH与OSA对照样品的溴化钾压片；待测滤网取1 cm2小片，用去离子水清洗3遍后干燥备用。利用红外分光光度计对材料表面进行扫描，并与标准药品的吸光度曲线进行对比。

1.2.2.2 LMWH定量检测

材料表面LMWH涂层密度的测定采用甲苯胺蓝定量方法，在参考文献［8］中的方法建立标准曲线（见式（1））后，取10 cm2样品，加入质量分数0.02％的TBO、PBS各2.5 mL，震荡混匀，室温反应50 min。利用紫外分光光度计，测量630 nm波长处的abs值，并根据标准曲线推算等价于肝素钠标准品的涂层密度（见式（2））。

1.2.2.3 OSA定量检测

材料表面OSA涂层密度的测定采用硫酸-苯酚多糖定量方法，在参考文献［9］中的方法建立标准曲线（见式（3））后，留取制备涂层前后的OSA反应液，用硫酸苯酚法处理后，用紫外分光光度计测量480 nm波长处的abs值，利用差值根据标准曲线推算等价于葡萄糖标准品的涂层密度（见式（4））。

1.2.3 生物相容性评价

1.2.3.1 表面接触角测定

待测滤网适当修剪，充分干燥，通过微量进样器在其表面滴加2 μL纯水，用动态接触角测量仪记录接触角不同时间点的变化。实验数据由SCA 202软件进行进一步分析。

1.2.3.2 涂层表面蛋白黏附检测

涂层表面黏附蛋白性能的测试使用BCA蛋白分析试剂盒，观察材料表面对人血清白蛋白及人血纤维蛋白原的黏附情况。参照说明书制作标准工作曲线（见式5），配制BCA工作液和0.2 mg/mL的蛋白稀释液。将10 cm2样品剪做碎片，加入1.5 mL蛋白稀释液，将材料完全浸没。置于恒温水箱中，37℃孵育1 h。取反应液100 μL，加入BCA工作液1 mL，在60℃恒温孵浴30 min。利用紫外分光光度计在562 nm进行测定，根据标准曲线，推算反应前后的蛋白量差值，即为材料表面的等价标准蛋白黏附量（见式（6））。

1.2.3.3 涂层表面血小板黏附测试

将健康志愿者全血以800 r/min离心10 min后，得到富血小板血浆，留样测定血小板计数PLT1；取10 cm2样品，剪成碎片，加入等量血浆，在37℃恒温水箱孵浴2 h后再次测定血小板计数PLT2（见式7）。

血小板黏附率=（PLT1－PLT2）/PLT1（7）

1.2.3.4 体外抗凝活性检测

抽取健康志愿者全血，3 000 r/min离心15 min，得到贫血小板血浆，留样测定凝血指标PT、TT、FIB、APTT。取10 cm2样品，剪成碎片加入等量血浆，在37℃恒温水箱孵育2 h后，再次取样测定凝血指标。

1.2.3.5 体外血栓形成试验

将待测滤网30 cm2真空干燥后称量干重W1，再将其置于12孔培养板内，迅速加入新鲜未抗凝全血2 mL浸没材料，37℃恒温孵育60 min取出样品。PBS冲洗3遍，3％戊二醛浸泡2 h，用梯度乙醇（体积分数分别为50％、60％、70％、80％、90％、98％）处理后低温真空干燥，再次称量干重W2，计算单位面积黏附量（见式（8）），并通过扫描电镜观察滤网表面血栓的形成情况。

1.2.4 应用安全性能评价

1.2.4.1 表面涂层动态脱落检测

以3只中空的未涂层滤器外壳作为容器，每组取100 cm2样品修剪待测，放入不同滤器，出口处以未涂层滤网拦截，保证样品不会脱出。连接体外循环机、泵管（30 cm），PVC管路（30 cm×2），预充PBS约250 mL。从转流开始（0 h），在此后1、2、4、8、16、32、64 h的时间点抽取转流液，OSA组采用硫酸苯酚法、LMWH组采用甲苯胺蓝法进行定量，PET组用两种方法定量。

1.2.4.2 流量及压力测试

AF两端连接带有侧孔的接头，并接入闭合的离心泵为动力的环路，将压力监测仪与侧孔连接。环路中预充聚明胶肽与生理盐水（3∶1），测试不同转速下的滤器进口端压力、流量变化，计算流量/转速比值。

1.3 统计方法

所有定量资料用“均数±标准差”表示，所得数据利用SPSS 17.0软件进行统计分析，用方差分析进行多组间比较，两两比较利用SNK-q检验，统计学差异检验标准P＜0.05。

2 实验结果

2.1 材料表面涂层定量及定性分析

涂层物质定量结果，LMWH组涂层密度等价于肝素钠标准品（42.3±8.5）g/cm2，而OSA组涂层密度等价于葡萄糖标准品（111.0±15.0）μg/cm2。

红外光谱可见图2，LMWH标准品在3 400 nm附近出现强吸收峰，OSA标准品在3 350 nm处出现强吸收峰，均为醛基吸收峰。PTE材料在3 000～3 500 nm波长处无吸收迹象，而涂层后材料在3 000～3 500 nm的吸光度增加，与LMWH、OSA标准品特征吸收峰趋势相同。

2.2 表面接触角测定

从表1中可见，与PET组相比，涂层后材料与水的表面接触角显著减小（P＜0.01）。与LMWH组相比，OSA组的接触角更小，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 材料表面蛋白吸附

从实验中发现（见表1），材料对蛋白的吸附量与接触角的大小有相同趋势，PET组对纤维蛋白原有强烈的吸附倾向，对白蛋白也存在一定程度的吸附，而涂层材料表面的纤维蛋白原与白蛋白吸附量均显著减少（P＜0.01），且OSA涂层表面的吸附蛋白少于LMWH涂层表面的吸附蛋白，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 材料表面接触角与表面血清蛋白成分的黏附（n=6）Tab.1 The contact angle and absorption of serum protein to the surface（n=6）

2.4 涂层表面血小板粘附

与PET组相比，涂层后材料血小板黏附率显著，差异有统计学意义（P＜0.01）。LMNH组血小板黏附率小于OSA涂层材料（P＜0.05）（见图3）。

图3 涂层前后血小板粘附比较（n=6）Fig.3 Comparation of plateletad here to material surface（n=6）

2.5 凝血功能4项

凝血功能检测发现，同接触材料前凝血指标相比，血浆与 PET组接触后，PT延长，APTT与 TT有不同程度的缩短，差异有统计学意义（P＜0.05）；血浆与LMWH组、OSA组接触后，PT变化无统计学意义（P＞0.05），APTT、TT延长，差异有统计学意义（P＜0.05）；与 LMWH组相比，OSA组对血浆APTT、TT影响较小，差异有统计学意义（P＜0.05），而PT变化差异无统计学意义（P＞0.05）。在不同条件下，血浆FIB变化均无统计学意义（P＞0.05）（见图4）。

图4 不同材料对凝血4项的影响（n=6）Fig.4 The effect of different material to coagulation indices

2.6 材料表面血栓形成实验

如表2所示，在全血浸泡后，样品的单位面积干重均有所增加。与涂层后材料相比，未涂层材料的质量显著增加（P＜0.01），LMWH组与OSA组间差异无统计学意义（P＞0.05）。电镜图片显示（见图5），PET组滤网的网孔大量堵塞（见图5（a）），甚至大面积地被血液成分覆盖（见图5（b）），而涂层材料滤网仅表面有少量异物，网孔仍然通畅（见图5（c）～（d））。

表2 全血浸泡后各组干重变化（n=6）Tab.2 The dry weight variation of all groups after soak in blood

图5 涂层前后材料表面血栓形成情况。（a）PET组（部分堵塞）；（b）PET组（严重堵塞）；（c）LMWH组（通畅）；（d）OSA组（通畅）Fig.5 The throm bus on the surfaces of different coating.（a）Group PET（partly blocked）；（b）Group PET（seriously blocked）；（c）Group LMWH（clear）；（d）Group OSA（clear）

2.7 涂层动态脱落检测

在动态脱落检测中（见表3），起始阶段（0 h）转流液中出现的涂层物质较多，可能为材料表面的残留反应液，此后便趋于稳定。在96 h的转流过程中，转流液中涂层物质变化（约10％）无统计学差异，表明96 h内两种涂层材料均无显著脱落，涂层结合牢固。

2.8 流量测试

在流量测试中，在转速为350～1 200 r/min范围内，涂层后滤器较PET组在相同转速下流量降低，流量/转速（F/R）减低，差异有统计学意义（P＜0.05）。转速超过1 500 r/min后，各组间流量、流量/转速差异无统计学意义（见表4）。涂层滤器之间的比较无统计学意义。

表3 涂层物动态脱落检测（n=6）Tab.3 The loss of the coating during analog ECC（n=6）

表4 各组滤器不同泵速下的流量变化（n=6）Tab.4 The variation of flow with different rotate speed（n=6）

2.9 压力测试

在压力测试中，与PET组相比，涂层后滤器相同泵速下入口侧压力（P＜0.01）、跨滤器压差（P＜0.05）有所增加，差异有统计学意义；两种涂层滤器间比较，相同泵速下入口侧压力、跨滤器压力无显著差异（见图6）。

3 讨论

体外循环是心外手术中生理功能出现紊乱的主要原因。Solberg的研究认为，ECC可能会引起广泛、未知的不良反应（比如凝血功能异常），并通过触发一系列旁路最终发展为全身的炎性反应；而过多的血小板黏附所导致的血小板减少，会导致术后的出血和恢复时间延长［10］。Gunaydin在回顾性分析中指出，这一系列反应已经被证实是血液和非生物相容性材料表面接触所致，而材料的生物相容性涂层可以有效地改善这一状况［11］。ECC的不良反应可能受到多方面的影响：涂层物质的种类和结构、气血接触面、血流动力学，以及和血液接触的异物表面（比如体外循环管路和AF）。在体外循环中，AF的主要功能就是减少潜在的微小气栓和血栓。Hussaini等认为，由于动脉微栓过滤器在体外循环设备中占据较大的接触面积，所以其生物相容性涂层对减轻术中的炎性反应有重要作用［12］。AF和ECC中其他的部件有很大的不同，比如外壳和滤网的材料、滤网孔径、预充量、最大血流比率、跨滤器压力、涂层材料以及滤器的结构对血流动力学的影响。生物相容性AF改善全身的炎性反应主要通过涂层材料及方法、滤器设计影响血流动力学变化。

图6 不同AF的流量-压力曲线（n=6）。（a）入口侧压力；（b）跨滤器压力Fig.6 The flow-pressure curve of different AF（n=6）.（a）The inlet pressure；（b）The trans-filter pressure

LMWH是临床常用抗凝药物，通过催化抗凝血酶Ⅲ与凝血酶X的反应，实现抑制凝血过程的作用，并且避免了完整肝素抗凝所带来的出血倾向和血小板减少等副作用［11］。目前，国外已有商品LMWH涂层设备的生产。OSA近年来广泛用作药物载体，关于其抗凝效果及抗凝机制尚不明确，但实验中发现OSA涂层同样具有抗凝活性。

由本研究可见，化学接枝改性的方法可以实现LWMH和OSA两种涂层与材料表面的稳固结合，显著改善了涤纶滤网的生物相容性。从红外光谱可见，涂层后材料与涂层物质特征峰处出现变化，虽然水化醛基也在该位置有吸收峰存在，但由于PET样品与涂层后样品在相同条件下测试，结合定量数据及生物相容性结果，可以证实材料表面有涂层物质存在。在生物相容性评价中，OSA涂层表面接触角较LMWH涂层更小，说明OSA涂层具有更好的亲水性，而相应地，OSA涂层表面黏附的蛋白成分（尤其是纤维蛋白原）也较LMWH更少。LMWH涂层表现出更好的抗血小板黏附，以及凝血激活时间的显著延长。Wan等采用等离子体技术处理涤纶材料，对其表面基团进行分析后推断，CO基团的增加是材料表面亲水性提高的主要因素之一［12］。而Zhu等研究认为，纤维蛋白原的疏水基容易与疏水性表面结合，引起构象变化，进而刺激血小板黏附激活、凝血因子激活等一系列凝血发硬，但亲水性材料表面形成的“调和膜”可以减少纤维蛋白原的附着，具有更好的血液相容性［15］。大量的活性醛基带有负电荷，使得OSA涂层具有一定的抗栓性能。所以，完善涂层方法，提高涂层浓度，探索不同氧化程度的OSA活性，增加活性醛基数量，可能对改善OSA涂层的抗凝活性有一定的推动作用。两种涂层滤网在全血成分接触后，仍能保持网孔的通畅，这有利于血液成分的保护，可保证滤器使用的安全性、持久性。

在模拟ECC中，滤网转流初始阶段出现较多的脱落物质，这可能与材料表面黏附的非共价结合的涂层物质有关，但整个转流液中脱落涂层的浓度十分稳定，为抗凝管理的安全性提供了保障。Wendel总结了涂层技术认为，稳定的涂层材料，将极大简化心脏手术中的抗凝管理，且更为安全［16］。涂层后滤器进口侧压力的增加、流量/转速比值的减小，可能与涂层后滤网的流体动力学变化有关，但压力仍在滤器标注范围内，且远低于上限220 mmHg。虽有统计学意义，但差异较小的跨滤器压力对血液成分影响很小。流量数据并无明确指标，但变化不大，且常规转速小，流量并无差异。经测试可发现，跨滤器压力、流量/转速虽有变化，但并不影响AF在ECC中的应用安全性。由于AF对纤维强度无明确要求，且电镜下未见纤维表面出现裂痕等异常变化，转流中无滤网破损，所以虽然未对纤维强度进行测试，但显然涂层滤网适用于长时间、高流量转流。

经过评价与检验可以认为，LMWH与OSA两种涂层的涤纶滤网都具有良好的生物相容性与应用安全性，其不同的生物相容性特点可以适用于不同需要。作为药物载体的OSA，成本低，易于获取，组织相容性好，不但可以推进AF在常规心脏手术中的应用，还具有更大的扩展空间，可用于制备复合涂层或应用于需要有良好组织相容性的医疗设备中。

4 结论

本研究用化学接枝改性的方法制备了结合稳定的LMWH涂层PET滤网和OSA涂层PET滤网，长时间转流无显著脱落。涂层后滤网的生物相容性显著改善，与血液接触后材料表面的蛋白黏附、血小板黏附显著减少，并具有良好的抗凝活性，表面血栓形成减少，滤网通畅，说明涂层后滤器应用的安全性能满足使用要求。OSA涂层与LMNH涂层相比，抗凝活性要略差，但有较好的亲水性，蛋白吸附量较少，可能会有更好的组织相容性，这有待于更多测试的验证。而且，OSA涂层成本低廉，也有更广阔的拓展空间。

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