P2X2/3受体在大鼠眶下神经慢性压迫性损伤中表达水平的动态变化

赵莉莉，雷 洁，王元银，，刘安东，解 敏，杨 晨，陈叶俊，孙 辉，周 健，王烈成，张志愿

(1.安徽医科大学口腔医学院，安徽省口腔疾病研究省级实验室，安徽合肥 230032;2.安徽医科大学基础医学院生理学教研室，安徽合肥 230032;3.上海交通大学第九人民医院，上海 200011)

目前多数学者认为三叉神经根的脱髓鞘改变是三叉神经痛(trigeminal neuralgia，TN)的病理基础。三叉神经节(trigeminal ganglion，TG)分布有P2X1-6等多种受体［1－2］，P2X2/3 受体高选择性地表达于中、小直径TG神经元中，与痛觉传递密切相关［3］。本实验拟建立大鼠眶下神经慢性缩窄性损伤(chronic constriction injury to the infraorbital nerve，CCIION)模型，观察其行为学改变及 TG神经元中P2X2/3受体表达量的动态变化，以探讨P2X2/3在CCI-ION所致的TN的TG神经元过程中的变化规律，为TN的临床治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 清洁级♂ SD大鼠85只，80～120 g。随机分为3组，正常对照组(Ⅰ组)5只;手术组(右侧为Ⅱ组，左侧为Ⅲ组)和假手术组(Ⅳ组)术后每周各取5只作相应的手术处理。

1.2 CCI-ION 模型建立 1.814 mol·L－1水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠仰卧位，消毒后作右侧眉弓上弧形切口，暴露眶下神经，两根结扎线间距约2 mm结扎眶下神经，Ⅳ组只暴露不结扎。

1.3 行为测试 将各组大鼠在术后每周行机械痛域测试，感觉测试仪由IITC Life Science公司提供，刺激部位为触须部位及周围有毛皮肤，轻触甚至未有任何触碰大鼠表现出明显的退缩、攻击或搔脸行为时记录为痛域值，每只大鼠刺激5次取平均值。

1.4 HE和免疫组化 术后每周处死大鼠取TG，HE染色行形态学观察，免疫组化方法检测P2X2/3的表达情况。

1.5 统计学分析 数据用SPSS17.0统计软件进行统计分析，以±s表示，各组各时间点与Ⅰ组比较采用单因素方差分析，组间比较采用独立样本t检验。

2 结果

2.1 行为学改变 模型组大鼠出现痛觉超敏现象，较Ⅰ组疼痛阈值明显降低(P＜0.01)。见Fig 1。

Fig 1 Changes of mechanical withdrawal threshold of ION-CCI rats in each group(n=5)

2.2 形态学改变 Ⅰ组:胞膜完整，胞核大小、形态正常，神经纤维光滑连续、粗细均匀。Ⅱ组:细胞染色不均，髓鞘增粗，纤维迂曲肿胀断裂(Fig 2)。

2.3 免疫组化染色 各组 TG中均能检测出P2X2/3免疫反应阳性细胞(Fig 3)。

Fig 2 Changes of the HE staining after the surgery in the control group and the CCI-ION surgery group

TG neuron，detected in middle and small diameter neurons A:P2X2 receptor;B:P2X3 receptor

2.3.1 P2X2/3表达阳性细胞率改变 镜下行阳性细胞和总细胞计数，得出阳性细胞率。Ⅱ组P2X2/3阳性细胞率明显提高，随着术后时间的延长呈现上下波动，但始终高于Ⅰ组水平(P＜0.01)。见Fig 4。

2.3.2 P2X2/3不同时间段的表达变化 用光学显微镜计算机图像分析系统测量背景灰度作P2X2/3的表达强度分析。Ⅱ组P2X2/3平均光密度一直明显高于Ⅰ组(P＜0.05)。见Fig 5。

Fig 4 Changes of the rate of positive cell experssing P2X2/3 receptor in trigeminal ganglion of each group after CCI-ION(n=5)

3 讨论

ATP 与神经系统的生理活动密切相关［4－5］，伤害性剌激使感觉神经末梢本身释放大量ATP激活P2X受体［6－7］，促进谷氨酸释放，诱发动作电位产生疼痛感觉［8－9］。研究显示P2X2/3受体参与多种疼痛产生的过程，P2X2主要介导急性神经病理痛，而P2X3主要介导慢性神经病理性痛的发生［10－11］。研究表明，CCI-ION模型可能损伤了包绕在神经元外的星形胶质细胞，释放ATP，从而导致神经元的激活并诱导产生神经性痛［12－14］。

Fig 5 Changes of P2X2/3 receptor experssion in trigeminal ganglion of each group after CCI-ION(n=5)

本实验通过对P2X2/3受体表达情况的检测发现，Ⅱ组P2X2/3的表达与其它各组相比呈上调趋势，1W阳性细胞率明显提高，推测可能是由于手术机械性损伤引起的代偿反应;P2X2/3平均光密度值较其它各组各时间点也明显增多，提示其与大鼠TN密切相关，介导了 TN的发生。Ⅳ组术后早期P2X2/3阳性细胞率及表达量较Ⅰ组均显著提高，晚期则差异无显著性，提示术后早期由于手术急性损伤造成急性期炎性反应，之后随着炎症的消退和TG的自我修复而有所恢复。Ⅱ组P2X2受体平均光密度2周升高达高峰后逐渐降低，5周后又表现出升高后降低的变化趋势提示P2X2可能与三叉神经痛的阵发性发作特征有一定关系，主要参与急性痛或炎性痛。与Ⅳ组相比，Ⅲ组在术后早期P2X3受体阳性细胞率及表达量差异均无显著性，而到晚期两者均明显高于Ⅳ组，并一直持续到观察结束，可能是由于术后早期由于手术损伤引起对侧继发炎性反应，后期手术侧痛觉的神经传导对对侧TG产生了影响，这与临床上TN的发病特征有相似性，但具体的作用机制需要进一步的研究。

综上所述，P2X2/3参与了TN的诱发、痛觉传递过程，其中P2X2主要参与急性痛或炎性痛，而P2X3对急性痛及痛疼的维持都起重要作用;而手术对侧组P2X3表达量的变化说明手术侧的痛觉神经传导对对侧TG产生了影响。

［1］Illesa P，Alexandre Ribeiro J.Molecular physiology of P2 receptors in the central nervous system［J］.Eur J Pharmacol，2004，483:5－17.

［2］DeseureK R，Adriaensen H F.Comparison between two types of behavioral variables of non-evoked facial pain after chronic constriction injury to the rat infraorbital nerve［J］.Comp Med，2002，52(1):44－9.

［3］Shinoda M，Kawahima K，Ozaki N，et al.P2X3 receptor mediates heat hyperalgesia in a rat model of trigeminal neuropathic pain［J］.J Pain，2007，8(7):588－97.

［4］Wang Y Y，Liu A D，Lei J.Pathways of purine receptor-mediated cytoplasmic calcium signal in acutely isolated small trigeminal ganglion neurons［J］.Neural Regen Res，2010，5(12):906－10.

［5］Ruan H Z，Birder L A，De Groat W C，et al.Localization of P2X and P2Y receptors in dorsal root ganglia of the cat［J］.Histochem Cytochem，2005，53:1273－82.

［6］Chen Y，Li G W，Wang C，et al.Mechanisms underlying enhanced P2X receptor-mediated responses in the neuropathic pain state［J］.Pain，2005，119(1－3):38－48.

［7］雷 洁，王元银，刘安东，等.ATP对大鼠三叉神经节小直径神经元胞内钙浓度的调制作用及其机制［J］.中国药理学通报，2010，26(11):1450－4.

［7］Lei J，Wang Y Y，Liu A D，et al.ATP-induced intracellular calcium signal transduction mechanism in the small trigeminale ganglion neurons of rat［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(11):1450－4.

［8］Khakh B S，North R A.P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease［J］.Nature，2006，442:527－32.

［9］潘阳杏，谢作磊，曹慧仁，等.慢性痛大鼠背根神经元基因表达的研究［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2006，13(13):144－9.

［9］Pan Y X，Xie Z L，Cao H R，et al.Study on gene expression of neurons in dorsal root ganglia of rat with neuropathic pain［J］.Chin J Neuroimmunol Neurol，2006，13(3):144－9.

［10］Dunn P M，Zhong Y，Burnstock G.P2X receptors in peripheral neurons［J］.Prog Neurobiol，2001，65:107－34.

［11］Shinoda M，Ozaki N，Asai H，et al.Changes in P2X3 receptor expression in the trigeminal ganglion following monoarthritis of the temporomandibular joint in rats［J］.Pain，2005，116(1):42－51.

［12］Giniatullin R，Nistri A，Fabbretti E.Molecular mechanisms of sensitization of pain-transducing P2X3 receptors by the migraine mediators CGRP and NGF［J］.Mol Neurobiol，2008，37(1):83－90.

［13］Simonetti M，Giniatullin R，Fabbretti E.Mechanisms mediating the enhanced gene transcription of P2X3 receptor by calcitonin gene-related peptide in trigeminal sensory neurons［J］.J Biol Chem，2008，283(27):18743－52.

［14］Fabbretti E，D’Arco M，Fabbro A，et al.Delayed upregulation of ATP P2X3 receptors of trigeminal sensory neurons by calcitonin gene-related peptide［J］.J Neurosci，2006，26(23):6163－71.