脑脊液中D-Ser对齿状回颗粒细胞层突触传递和可塑性相关蛋白的作用研究

谢奇辰，殷卫东，钱天秀，陈思维，王晓英

(1.中国医学科学院药用植物研究所药理中心，北京 100193;2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，辽宁 沈 阳 110016;3.山东淄博临淄区人民医院，山东 淄博 255400)

包绕大脑的脑脊液中富含各种神经递质，由于脑内神经元胞外液与脑脊液互相的交换和交流，所以脑脊液几乎含有所有大脑调节物质，成为大脑调节物质分泌、传输、交流的场所。近年来，由于D-Ser在神经元和胶质细胞对话联系中担任重要角色而成为神经科学领域的研究热点。大量研究证实，D-Ser是NMDA受体甘氨酸位点的内源性配基，由L-Ser经胶质细胞富含的丝氨酸消旋酶产生而来［1－3］。临床研究也发现神经精神病人如精神分裂病人以及老年痴呆病人脑脊液中的D-Ser浓度与正常人水平具有明显差别，所以深入研究中枢神经系统中D-Ser的功能作用对于神经精神相关疾病病理机制的研究以及药物发现具有重要理论意义。

1 材料与方法

1.1 动物和手术 ♂ SD大鼠，体质量300～350 g，单笼饲养(光照:07∶00～19∶00 h)。动物以苯巴比妥钠(60 mg·kg－1，ip)。麻醉后，固定于离体定位仪，进行侧脑室定位，打孔，种植给药娄管。同时另钻孔以3个小螺丝将其固定，以牙托粉固定。3 d后，隔天进行 IgG 2.5 g·L－1和 anti-D-Ser IgG 2.5 g·L－1(购自 United States Biological)注射，注射 3次后，动物进行电生理测定和蛋白表达测定。

1.2 实验仪器 VC-11记忆示波器 (Nihon Koden，日本);SEN-7203三道电子刺激器(Nihon Koden，日本);SS-202 J刺激隔离器(Nihon Koden，日本);SR-6N立体定位仪 (Narishige，日本)。

1.3 电生理测定［4］最后1次Anti-D-Ser IgG注射后2 h，以乌拉坦麻醉大鼠(1.5 g·kg－1，ip)，固定于离体定位仪，以同样的方法埋植刺激电极和记录电极。刺激电极定位坐标为:P 7.5－7.8，L 4.4－4.6，H 3.5－4.0;记录电极坐标为:AP 3.7－4.0，L 2.4－2.7，H 3.0－3.5。根据已定位坐标的位置，将给药篓管及记录电极放入所在脑区。以固定强度的刺激记录慢慢调整刺激和记录电极的位置，直到诱导出最大群峰电位。而后给予不同强度的电刺激，记录诱发的动作电位，得到输入输出曲线。刺激(0.033 Hz，100 μs)电流强度以引起最大兴奋性突触后电位的1/2－1/3为检测刺激强度，之后将电极固定。以高频刺激(HFS，100 Hz，100 μs，10 串，5 个刺激方波，串间隔刺激为200 ms)，诱导LTP刺激强度与测试刺激相同。

1.4 诱发电位的记录和幅值的计算方法 实验中以PS幅度相对值(%)为观测指标，观察其给药后的增幅情况。将给药前30 min所记录的6个时间点PS幅度值的平均值作为自身基础突触传递水平(自身基础幅值)，并以此PS均值为100%。用给药后所测各时间点的PS幅度值除以基线的6个时间点的PS平均值，得到各时间点的PS幅度相对值。

1.6 Western blot检测和抗体 Western blot操作流程如前所述进行操作［5－6］。大概步骤如下，将皮层、海马在预冷的RIPA缓冲液中(1%Igepal CA-630，0.5%sodium deoxycholate，0.1%SDS，1 mmol·L－1PMSF，10 g·L－1aprotinin，1 mmol·L－1sodium orthovanadate in PBS buffer，pH 7.4)超声匀浆，以BCA测定试剂盒检测蛋白浓度，匀浆液以2x SDS-PAGE上样缓冲液稀释至2 g·L－1，样本蛋白进行电泳分离，然后转移至PVDF(Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)膜。PVDF膜与溶于含有5%脱脂奶粉的PBS缓冲液的一抗在4℃孵育通宵。各一抗浓度如下:GAP43(1∶4 000，购自美国Cell Signaling Technology)，Synapsin Ⅰ，MAP2(1 ∶700，购自美国 Cell Signaling Technology)。而后，膜以PBS进行3次震荡冲洗，与二抗1∶5 000室温孵育60 min，同样进行冲洗后，以ECL显色法进行冲洗(购自Pierce Biotechnology)，条带以NIH imagine进行半定量分析。

Fig 1 Baseline of PS amplitude in perforant path-dentate gyrus synapse(±s，n=5)

2 结果

2.1 脑脊液中D-Ser对齿状回颗粒细胞层突触传递的影响 如 Fig 1所示，在测试刺激(0.033 Hz，100 μs)下，对照组 PS 幅度在 10、30、60、90 min 分别是(103.2±8.6)%、(97.6±7.6)%、(100.5±8.2)%、(97.3±7.3)%，anti-D-Ser组的PS幅度分别为(99.8±7.2)%、(95.6±7.4)%、(103.2±9.6)%、(102.5±8.7)%。对照组和 anti-D-Ser组的基础突触传递至90 min时没有明显变化，呈现稳定状态。

HFS(100 Hz，100 μs)高频刺激后，在 10、30、60 min的 PS幅度为(182.4±15.1)%、(175% ±13.5)%、(177.8±15.6)%，相比较而言，高频刺激后10、30、60、90 min 后 Anti-D-Ser组的 PS 幅度分别为(112.3±9.8)%、(120.3±12.0)%、(118.3±13.6)%。anti-D-Ser组PS幅度下降，anti-D-Ser IgG抑制了齿状回LTP的诱导(Fig 2)。

Fig 2 Effect of anti-D-Ser IgG on efficacy of synaptictransmission in perforant path-dentate gyrus synapses(±s，n=5)

2.2 脑脊液中D-Ser对突触可塑性相关蛋白表达的影响 如Fig 3～5所示，大鼠皮层和海马部位用于检测抗D-Ser IgG注射后蛋白表达的变化以观察脑脊液中D-Ser对突触可塑性的影响。抗D-Ser IgG使皮层的GAP-43表达升高约52%，海马部位约58%。而抗D-Ser IgG组皮层MAP2的表达降低约32%，海马降低约59%。抗D-Ser IgG使皮层的synapsinⅠ表达降低约45%，海马部位降低约57%。结果显示了抗D-Ser IgG注射后MAP2和SynapsinⅠ的表达在海马和皮层均下降，而且海马MAP2和SynapsinⅠ蛋白的表达对脑脊液中D-Ser浓度的变化较皮层更为敏感。

Fig 3 Western blot of GAP-43 expression in control and anti-D-Ser IgG-treated rat brain(±s，n=5)

Fig 4 Western blot of MAP2 expression in control and anti-D-Ser IgG-treated rat brain(±s，n=5)

Fig 5 Western blot of Synapsin I expression in control and anti-D-Ser IgG-treated rat brain(±s，n=5)

3 讨论

我们曾验证了脑脊液中物质对中枢神经系统功能具有调节作用，如慢性ET-1免疫球蛋白注射可调节内源性鸦片系统［5－6］。包绕大脑的脑脊液中富含各种神经递质，由于脑内神经元胞外液与脑脊液的互相交通，脑脊液几乎含有所有大脑调节物质，包括氨基酸。所以脑脊液提供了一个大脑调节物质分泌、传输、交流的场所。有研究表明，中枢神经精神相关疾病患者脑脊液中某些蛋白的参数会发生明显改变，Hashimoto等［7］报道临床精神病患者脑脊液中的D-Ser水平明显下降，D'Aniello等［8］发现老年痴呆病人脑脊液中的两种氨基酸呈现出明显变化。Bendikov等［9］报道了D-Ser浓度明显影响了精神病病人的临床症状。我们在前期工作的基础上［4－5］，以抗D-Ser IgG进行中枢注射，降低脑脊液中的 DSer水平，来反向推测D-Ser在其中的作用。结果表明抗D-Ser IgG明显阻碍了齿状回颗粒细胞层LTP的诱导，本研究所进行的在体实验的结果与Henneberger等所报道的离体实验的研究结果相吻合［10－11］，同时海马和皮层部位的突触可塑性相关蛋白的表达也发生了明显的变化。突触可塑性相关蛋白的表达为突触形态变化的内在机制，如生长相关蛋白GAP-43、微管相关蛋白MAP-2以及突触素synapsinⅠ。MAP2存在于神经元的胞体、树突和树突棘，参与构成细胞骨架、突起生长、胞质蛋白运输、神经元塑形等功能，其丢失涉及到神经元结构破坏，导致神经功能障碍。抗D-Ser IgG使皮层和海马的MAP2表达降低。突触素synapsinⅠ特异性定位于轴突终末的突触囊泡膜上，反映轴突终末结构的分布［12］。synapsinⅠ的改变可能引发多种神经精神障碍，它通过磷酸化与去磷酸化作用调节神经递质释放、参与突触发育，是突触功能的物质基础［13－14］。抗D-Ser IgG使皮层和海马synapsinⅠ表达降低，同MAP2的变化一致。临床发现精神病人脑脊液中的D-Ser水平明显下降，病人死后检测结果表明其海马的 MAP-2表达亦呈明显性下降［15－16］，这同本研究的结果相吻合。

有趣的是我们发现海马MAP2和SynapsinⅠ蛋白的表达对脑脊液中D-Ser浓度的变化表现出更高的敏感性。本研究发现中枢注射抗D-Ser IgG后，海马部位的MAP2和synapsisⅠ蛋白表达的变化较皮层更为敏感。这涉及到一个中枢抗体注射后的扩散均匀度和作用是否彻底的问题，也即抗体进入后是通过局部扩散渗透到脑组织中作用还是通过脑脊液进行作用，也曾有报道认为IgG进入侧脑室后会不能均匀分布［17］，我们曾就此进行了专门的验证［5－6］，我们采用了大脑匀浆进行检测，并没有发现残留的IgG，也没有发现皮层或海马部位残留的IgG。结果表明抗D-Ser IgG通过侧脑室进入中枢后，进行了有效的全脑作用，与学习记忆能力有密切关系的海马对D-Ser水平的变化更为敏感。

相比之下，GAP-43蛋白的表达在海马和皮层均呈上升趋势，GAP-43主要分布于生长锥和突触前末端，可促进神经元的生长、发育、神经再生及突触重建。在生长锥，GAP-43可促进F-肌动蛋白的聚集，使生长锥在形态上更具活力，并抵抗其回缩。我们推断GAP43表达的增加是由在抗D-Ser IgG进入中枢后所导致的突触传递的障碍所引起的蛋白表达的负反馈反应所致。Rekart和Chambers等也报道了相似的临床检验结果，老年痴呆患者死后解剖分析结果显示伴随着D-Ser水平的降低，其GAP-43在海马腔隙分子层，以及精神分裂病人的门区，内分子层的表达升高［18－19］，本研究结果与临床研究的新发现是相吻合的。

总之，研究结果表明脑脊液中D-Ser具有重要的中枢调节作用，这对精神分裂病人和老年痴呆患者的临床治疗新药物和治疗方法的发现提供了理论支持。

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