TNFRSF11B基因多态性与肌肉量的关系①

王静，李响，解端阳，陈艳，蒋晓燕

TNFRSF11B基因是肿瘤坏死因子受体超家族的一个成员，其基因产物为骨保护素(osteoprotegerin,OPG)，具有抑制破骨细胞形成、分化、存活并诱导破骨细胞凋亡的功能，是体内成骨细胞骨形成与破骨细胞骨吸收动态平衡的重要调节因子。有研究显示，TNFRSF11B基因的遗传变异与骨密度和骨质疏松症骨折密切相关[1-3]。既往研究表明，适当的体重对人体骨密度有正性作用，而骨的负荷主要来源于肌肉的主动收缩[4]；也有研究者认为，肌肉质量与骨密度关系显著[5]。那么与骨密度密切相关的TNFRSF11B基因的遗传变异是否与肌肉量相关呢？本研究旨在探索TNFRSF11B基因8个标签单核苷酸多态性(tagging single nucleotide polymorphism,tSNP)对人体不同部位肌肉量水平的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 随机收集2006年1～12月济南市妇幼保健院健康志愿者419人。所有个体均为济南市常住汉族居民，其中男性203人，女性216人；年龄18～74岁，平均(49±12)岁。排除有慢性疾病或正在服药者。所有受试者均签署知情同意书[6]。

1.2 肌肉量测定 采用GE公司(原LUNAR公司)DPX2NT双能X线骨密度仪测量全身各部位肌肉量。测定时要求受检者只穿贴身衣裤，不佩戴任何含金属的物件；整个测定过程由3名专职工作人员负责操作；仪器由微机控制，自动分析打印结果。每日测量前均进行校准和仪器质量控制，CV＜0.5%。

1.3 单核苷酸多态性选择 采用tSNP策略。TNFRSF11B基因tSNP选择和基因分型数据来自人类基因库(http://www.hapmap.org/cgi-perl/gbrowse/hapmap 27_B36/)中的汉族人群。所有tSNP以LD相关系数r2=0.8，最小等位基因频率(MAF)＞5%为选择标准，选出TNFRSF11B基因8个tSNP位点。

1.4 单核苷酸多态性检测 所有研究对象抽取外周血3 ml，2%依地酸二钠(EDTA)抗凝，置于-20℃冰箱中储存。采用酚-氯仿法抽提基因组DNA，定量标化至10 ng/ml，应用ABI 7900HT基因分型平台及相应软件(ABI，Foster City，CA)检测。

1.5 统计学分析 使用SPSS 15.0软件对数据进行统计分析。计量资料以(±s)表示；不同基因型组之间的全身各部位肌肉量的比较采用方差分析(ANOVA)；协方差分析校正性别和年龄的影响；显著性水平α=0.05。

2 结果

所有对象全部进入分析，无脱落。各部位肌肉量见表1。TNFRSF11B基因的8个tSNP位点是rs2875845、 rs1485288、 rs11573869、 rs3102727、rs3102728、 rs11573849、 rs3134062、 rs1385503。 利用Taqman基因分型技术对样本进行基因分型，基因分型的成功率分别为97.9%、99.0%、97.9%、97.4%、99.8%、98.6%、98.3%、98.8%。基因型在济南汉族人群的分布符合Hardy-Weinberg平衡。各基因位点的基因型频率见表2。

SNP rs2875845位点AA、AG、GG基因型携带者个体左右上肢、下肢、躯干等部位肌肉量及总肌肉量依次增加(P＜0.05)。见表3。SNP rs1485288位点 CC、CT、TT基因型携带者个体的躯干肌肉量及总肌肉量依次增加(P＜0.05)。见表4。在校正了年龄与性别后仍然具有统计学意义。其他位点与全身各部分肌肉量未见显著性差异。

表1 各部位肌肉量(g)

表2 TNFRSF11B基因tSNP基因型频率和特性

表3 TNFRSF11B基因rs2875845位点多态下各部位肌肉量(g)

表4 TNFRSF11B基因rs1485288位点多态下各部位肌肉量(g)

3 讨论

人类TNFRSF11B基因位于染色体8q24，长度为28587 bp，包括5个外显子和5个内含子。我们选择的8个tSNP都位于第1内含子。TNFRSF11B基因第1内含子占基因全长的66.3%。到目前为止，此基因中被研究的大多数SNP集中于启动子区、第1外显子及第1内含子区域。我们首次在济南汉族人中发现，TNFRSF11B基因第1内含子的rs2875845和rs1485288多态同中国汉族人的肌肉量相关。随着rs2875845和rs1485288位点G、T等位基因拷贝数增加，肌肉量也随之增加。

骨保护素参与骨密度改变的基本过程。成骨细胞系细胞分泌骨保护素，与核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)竞争性结合，促进了RANKL与RANK的结合，抑制破骨细胞的分化和骨吸收活性[7]。骨保护素可通过肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)在肿瘤疾病中促进肿瘤细胞的凋亡，从而提高结肠癌、肺癌、膀胱癌等肿瘤患者的存活率。血清骨保护素还影响着冠心病和外周血管病的严重程度[8-9]。TNFRSF11B的遗传变异影响着复杂性状多基因遗传疾病的发生。

肌肉量一方面受氧耗和代谢的影响，另一方面亦与许多激素有关，如脂肪组织分泌的瘦素、雌激素、脂联素；消化道分泌的胃饥饿素刺激生长激素；胰腺分泌的胰岛素等[10]。相关性研究发现，体重指数的增加同骨密度增加成正相关[11]。在以肌肉量增加为主的肥胖相关性研究显示，肌肉组织比脂肪组织对骨密度的变化影响更大[12]。

本组研究对象均是生活在济南的汉族人，生活方式等环境因素较类似，同质性较好，所以我们没有将营养、生活习惯、地理环境等环境因素作为混杂因素来处理。为增加人群的代表性，我们检查了不同年龄的成年人样本，而且在募集志愿者时，尽可能通过多个渠道，以增加对总体的代表性。在肌肉量的测量上，我们采用国际通用的双能X射线骨密度仪，严格按程序测量，并加强质控，尽可能减少信息偏倚。

目前研究肌肉量的遗传因素报道较少，既往研究显示睫状神经营养因子基因、肌肉生长抑制素基因、Ⅰ型胶原α1基因、维生素D受体基因、胰岛素样生长因子基因的遗传变异影响与肌肉相关的表型[13-16]。我们的研究旨在探索TNFRSF11B基因8个tSNP是否影响人体不同部位肌肉量的水平。TNFRSF11B基因tSNP中的rs2875845和rs1485288位点在中国汉族人中处在不同的单倍型区域。rs2875845代表7个SNP位点 ： rs1994276、 rs11573838、 rs10505346、rs10955911、rs11573896、rs1994276、rs1485287；而rs1485288位点仅代表它自己，可能在Hapmap数据库中，与它连锁的变异位点还没有被检测到。

本组人群中，SNP rs2875845和SNP rs1485288的LDs很弱，说明这两个位点可能都仅代表着不同致病位点的遗传标志物。同rs2875845位点强连锁的rs10505346位点为一个功能性致病位点，与术前前列腺特异性抗原(preoperative prostate-specific antigen,PSA)水平相关，可能是影响前列腺癌根治术后是否复发的一个预后因素[17]。但它们自身与各种多基因复杂疾病的关系研究未见报道，它们的功能也不得而知。一般而言，第1内含子的变异较其他部位内含子变异更有可能是功能变异。位于结构基因第1内含子的SNP可能促进或抑制转录[18-19]，从而导致不同等位基因对转录的调控不同。

TNFRSF11基因多态性与肌肉量表型的关联研究国内外均未见报道。我们的研究仅提示其中两个多态性位点(rs2875845和rs1485288)可能是影响肌肉量水平的一个因素。鉴于TNFRSF11基因参与众多疾病病理生理的过程，而肌肉量与运动、骨密度、肥胖等密切而复杂的关系，其具体分子机制尚需进一步深入研究。且不同人群有不同的遗传结构，故我们的结果需要在不同人群中进一步重复验证。

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