千屈菜科中rpl2基因内含子缺失现象探析

施雨彤，徐 梁，郑绍宇，顾翠花

（1. 浙江农林大学 风景园林与建筑学院，浙江 杭州 311300；2. 浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023）

千屈菜科Lythraceae植物有31个属600多个种，大多数植物为草本，灌木或乔木，适应性强，千屈菜属为本科模式属，广布于全世界，主要分布于热带和亚热带地区，我国有1属，约47属种，南北均有[1]。根据植物形态、解剖和植物胚胎学角度证明其与柳叶菜科 Onagraceae在生物进化过程中关系密切，同属于桃金娘目Myrtiflorae[2]。千屈菜科紫薇属 Lagerstroemia植物为落叶或常绿的乔木或灌木，根据国际植物名称检索表（International Plant Names Index）报道，虽部分种类存在争议但数量达到近80种[3]。紫薇属植物大多数种类花大色艳，树形优美可爱，夏季开花时间长，木质优良，纹理美观，是园林造景、家具用材的优良树种，具有较高的经济价值。国内外紫薇属植物研究主要集中在新品种选育、繁殖、形态分类、生理生化等方面[4-6]。国内关于紫薇叶绿体基因组内含子的研究较少，而在植物进化过程中基因的内含子丢失现象广泛发生。对鼠耳芥Arabidopsis thaliana的研究发现内含子丢失与植物基因突变率有明显相关性[7]，这为紫薇叶绿体基因组内含子研究及紫薇育种在分子水平上提供了参考。

真核生物细胞基因 DNA中把编码区域间隔开来的序列为内含子（Intron），在基因转录后剪接去除[8]，内含子作为真核生物基因组的组成部分，与基因表达过程关系密切，内含子极大的丰富了转录产物的数量和种类，并在mRNA剪接过程中起着复杂的调节作用，从而影响基因表达[9-11]。内含子的缺失在物种进化过程中一直不断发生，比如豆科Leguminosae山蚂蝗族Trib. Desmodieae以及单子叶和双子叶植物中均有记载[12-13]。rpl2基因（核糖体大亚基蛋白2，ribosomal protein gene 2）是叶绿体中组成RNA基因的核糖体蛋白大亚基基因，其编码核糖体蛋白L2的过程是系统的关键，与植物的光合作用密切相关，对植物的抗性和生长发育起着重要作用。在基因种类和排序上，叶绿体DNA非常保守。在进化过程中，cpDNA的某些结构依然保持不变，为研究物种的进化过程提供了行之有效的途径。

有学者在屋久岛紫薇Lagerstroemia fauriei叶绿体基因组研究的过程中，发现其rpl2基因的内含子存在缺失现象[14]，因此，本研究对紫薇属乃至千屈菜科进行了取样，针对内含子区域设计了引物，进行PCR扩增，测序分析，来研究rpl2基因内含子缺失发生在属的水平还是科的水平，以期对后续研究紫薇系统发育过程中基因的变化提供了一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究共采集9属25种相关材料（表1），其中部分物种取自国外。

表1 实验样本Table 1 Experimental samples

实验设计采用了与千屈菜科紫薇属近缘的月见草属Oenothera植物O. albicaulis作为参照，同时选取模式植物鼠耳芥、近缘科桃金娘科Myrtaceae的物种Angophora costata，Corymbia eximia，Eucalyptus aromaphloia，Eugenia uniflora，Stockwellia quadrifida , Syzygium cumini[15-20]等6种植物的样品（表2）。取样后立即投入液氮，于－80℃保存备用。通过植物基因组DNA提取试剂盒提取实验样本的总DNA，试剂盒为北京天根生化科技有限公司生产。提取到25种样本的合格DNA，以进行下一步实验。部分实验样品为国外采集，《中国植物志》中并未收录，缺乏与之对应的中文名称，在表格中以拉丁文为准，如 Angophora costata，Corymbia eximia，Eucalyptus aromaphloia，Eugenia uniflora，Stockwellia quadrifida and Syzygium cumini，Heimia salicifolia，Cuphea aequipetala，Oenothera albicaulis等；同时涉及新种如密毛紫薇，参照相关文献，表中关于石榴属的分类参照国际最新分类系统[16]，具体实验样本名录见表2。

表2 实验样本Table 2 Experimental samples

1.2 DNA序列的PCR扩增

根据GenBank中登录的rpl2基因已知序列，设计了2对引物，正向引物（CAAAACTTCTACCCCAAGCA）和反向引物（TCTTCTTCCAAGTGCAGGAT），以基因组DNA作为模板对样品进行40 μL体系特异性扩增，扩增体系为：4 μL 10×Taq buffer，0.8 μL dNTP（10 mM），0.4 μL Taq polymerase（5 U·μl-1），0.5 μL 上下游引物（20 pmol·μL-1），所有体系来自上海生工，0.5 μL DNA 模板和 33.3 μL ddH2O，反应程序为，94℃预变性 5 min；94℃变性45 s，55℃预变性45 s，72℃延伸45 s，72℃延伸2 min，共32个循环；4℃保存。反应结束后量取8 μL反应产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.3 PCR产物的回收

按照biomega纯化试剂盒说明书进行PCR产物纯化回收。

1.4 基因结构和内含子信息分析

利用NCBI数据库提供的SIpidey[21]工具分析所获得的rpl2基因结构，并利用PlantCARE[22]对rpl2基因内含子进行转录位点分析。

2 结果与分析

2.1 千屈菜科植物与月见草属物种O. albicaulis rpl2基因比较

本实验运用PCR技术特异性扩增了紫薇属的17种和千屈菜科内其他7属中的物种rpl2基因区域，同时也扩增了千屈菜科外的一种月见草属物种O. albicaulis作为对比参照。对PCR产物进行1%琼脂糖电泳检测，结果如图1（样品来自表1）。从图1中可直观地看出，不含有rpl2内含子的目标片段的长度约为750 bp，而O. albicaulis内含子的完整片段约为1 400 bp，从片段的长度上直观的说明了除O. albicaulis之外，千屈菜科植物存在rpl2基因内含子缺失，除了缺失的内含子之外，两个外显子部分与其他物种的外显子序列存在高度相似性。

2.2 紫薇属植物与千屈菜科内其他物种的比较

同时对紫薇属内17个物种和千屈菜科内其他7个物种的PCR产物进行了测序，见图2。由图2测序结果进一步证实了rpl2基因内含子在24种测试样本（千屈菜科）中缺失。如图2A所示，本研究选取对比了7种植物的rpl2基因结构，包括模式植物鼠耳芥、近缘科桃金娘科的物种Angophora costata，Corymbia eximia，Eucalyptus aromaphloia，Eugenia uniflora，Stockwellia quadrifida and Syzygium cumini以及柳叶菜科月见草属物种O. albicaulis，在这7个物种的rpl2基因中，两个外显子之间都包含一个660 bp左右的内含子，图2B为这7个物种的内含子两个边界的部分外显子序列，图2C主要对千屈菜科代表物种进行了rpl2基因的测序，蓝色背景区域与黄色背景区域均为外显子序列，中间未出现任何核苷酸。测序结果与比对证明rpl2基因内含子在紫薇属内发生了缺失现象。

图1 PCR产物电泳检测结果Figure 1 Result of electrophoresis test of PCR

图2 rpl2基因测序结果Figure 2 Result of gene sequencing

3 结论与讨论

本研究通过收集的25种样本，其中紫薇属样本17种，千屈菜科其它属7种，利用柳叶菜科月见草属物种O. albicaulis为对照。通过试剂盒法提取DNA，并PCR扩增样本rpl2目标区域基因片段，利用PCR扩增测序测出实验样本的rpl2目标区域长度短于非千屈菜科植物，对扩增片段的Sanger测序结果进行比对，确认rpl2内含子缺失现象发生在紫薇属及千屈菜科内。通过分子生物学的研究，了解其基因组信息所对应的性状以及其进化历程，对培育紫薇新品种提供一定的基础。

之前的研究表明80%～85%的高等植物的叶绿体基因组都有内含子，但是不同物种内含子数目不同[18]。陆生植物的叶绿体基因组在进化上相对保守，其基因内容，基因顺序，结构和大小变化都比较小，即便在苔藓植物中大量内含子的剪接位点仍与鼠耳芥Arabidopsis thaliana相同[10,23-24]。由于数量较少，其基因组的主要结构突变（如倒置，插入或基因和内含子的缺失等）通常可以为特定植物群落的单系进化提供强有力的证据。

内含子的大量丢失导致叶绿体基因组主要结构的突变、缩小[24]。同时根据突变率与内含子丢失的相关性可以推断出，高突变率的基因导致的内含子丢失速率更高，同时相应的内含子的丢失有时也会影响基因的表达效应，造成表型的变化[25]。内含子多态点位可以作为植物性状筛选的分子指标，千屈菜科紫薇属内rpl2内含子的缺失研究结果可以在后续研究中作为性状筛选的指导。内含子通过mRNA介导反转录重组丢失，根据内含子丢失已知模型，内含子的准确丢失在较长的基因中检测到具有位置偏好性[26]。内含子的丢失在一定程度上反映了物种进化速率；进化较快的物种保留更少的祖先内含子[27,28]，该研究中千屈菜科紫薇属以及其他属的植物都发生内含子丢失，后续可以通过内含子多态性位点、物种相同基因内含子的丢失来鉴定植物进化程度。

rpl2内含子并不存在于所有的陆生植物。DNA测序结果表明rpl2内含子存在于茄科Nicotiana debneyi中，但在菠菜Spinacia oleracea中未发现。随后的研究显示，rpl2内含子在被检测的6种陆生植物的叶绿体DNA中存在，其中包括2种双子叶植物，3种单子叶植物和一种苔藓类植物。这6种陆生植物的内含子的同源性是通过其在基因中的保守位置和其高度保守的一级序列来表示。因此，rpl2内含子存在于被子植物的共同祖先中，但随后消失在谱系中，从而导致了菠菜中rpl2内含子的缺失[11]。

目前已经确定rpl2基因分布于116科390种被子植物中。rpl2内含子的缺失现象已经在双子叶植物的其他五个科中出现，虎耳草科Saxifragaceae，旋花科Convolvulaceae，睡菜科Menyanthaceae，牻牛儿科Geraniaceae的两个属，和茅膏菜科Droseraceae的一个属。该内含子缺失表明千屈菜科植物和采样的其他千屈菜科其他属的种存在结构上的差异。由此可知，在物种进化过程中rpl2基因内含子已经发生了多次独立的缺失[14,29]。

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志[M]. 北京：科学出版社，1983，52（2）：62.

[2] GRAHAM S A，HALL J，SYSMA K，et al. Phylogenetic analysis of the Lythraceae based on four gene regions and Morphology[J]. Int J Plant Sci，2005，166（6）：995－1017.

[3] 张洁，王亮声，张晶晶，等. 紫薇属植物研究进展[J]. 园艺学报，2007，34（1）：251－256.

[4] 张启翔. 紫薇品种分类及其在园林中的应用[J]. 北京林业大学学报，1991，13（4）：57－66.

[5] 贾文庆，刘会超，姚连芳. 紫薇花粉萌发特性研究[J]. 西北林学院学报，2007，22（6）：18－20.

[6] 童俊，叶要妹，冯彪，等. 秋水仙素诱导三种紫薇多倍体的研究[J]. 园艺学报，2009，36（1）：127－132.

[7] 杨宇飞. 鼠耳芥和琴叶鼠耳芥中内含子丢失和突变率关系[D]. 北京：北京师范大学，2013，10－20.

[8] Alberts B，Johnson A D，LEWIS J. Molecular biology of the cell [J]. Garland Sci，2008，10（9）：8153－4072.

[9] 王玲平. 不同生物中内含子大小和丰度系统分析[D]. 北京：中国科学院大学，2014.

[10] KREBS J E，GOLDSTEIN E S，KILPATRICK S T. Lewin’s Gene X [M].Beijing: Science Press，2009：58－62.

[11] CHOW L T，GELINAS R E，BROKER T R，et al. An amazing sequence arrangement at the 5' ends of adenovirus 2 messenger RNA[J]. Cell，1977，12（1）：1－8.

[12] DOWNIE S R，OLMSTEAD R G，ZURAWSKI G，et al. Six independent losses of the chloroplast DNA rpl2 intron in Dicotyledons: molecular and phylogenetic implications[J]. Evolution，1991，45：1245－1259.

[13] BAILEY C D，DOYLE J J，KAJITA T，et al. The Chloroplast rpl2 intron and ORF184 as phylogenetic markers in the Legume Tribe Desmodieae[J]. Syst Bot，1997，22：133－138.

[14] GU C H，TEMBROCK L R，JOHNSON N G，et al. The complete plastid genome of Lagerstroemia fauriei and loss of rpl2 intron from Lagerstroemia (Lythraceae)[J]. Plos One，2016，11（3）：1－18.

[15] GRAHAM S A，HALL J，SYTSMA K，et al. Phylogenetic analysis of the Lythraceae based on four gene regions and morphology[J]. Int J Plant Sci，2005，166（6）：995－1017.

[16] HILL K D，JOHNSON L A S. Systematic studies in the eucalypts7. A revision of the bloodwoods, genus Corymbia (Myrtaceae)[J]. Telopea，1995，6（2－3）：185－504.

[17] CHAPPILL J，LADIGES P Y，BOLAND D. Eucalyptus aromaphloia Pryor & Willis-a redifinition of geographical and morphological boundaries[J]. Aust J Bot，1986，34（4）：395－412.

[18] TURCHETTO-ZOLET A C，SALGUEIRO F，TURCHETTO C，et al. Phylogeography and ecological niche modelling in Eugenia uniflora(Myrtaceae) suggest distinct vegetational responses to climate change between the southern and the northern Atlantic Forest[J]. Bot J Lin Soc，2016，182（3）：670－688.

[19] CARR D J，CARR S G M，HYLAND B P M，et al. Stockwellia quadrifida (Myrtaceae), a new Australian genus and species in the eucalypt group[J]. Bot J Lin Soc，2015，139（4）：415－421.

[20] HELMSTÄDTER A. Syzygium cumini (L.) Skeels（Myrtaceae）against diabetes-125 years of research [J]. Pharmazie，2008，63（2）：91－101.

[21] KAPUSTIN Y，SOUVOROV A，TATUSOVA T，et al. Splign: algorithms for computing spliced alignments with identification of paralogs[J].Biol Direct，2008，3（1）：20.

[22] LESCOT M，DÉHAIS P，THIJS G，et al. A database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences [J]. Nucl Acids Res，2002，30（1）：325－327.

[23] 杨桢. microRNA相关的生物信息学与进化分析[D]. 上海：复旦大学，2011，80－90.

[24] ROESLER K R，SSHORROSH B S，OHLROGGE J B. Structure and expression of an Arabidopsis actyle-coemzyme A carboxylase gene[J].Plant Physiol，1994，105：611－617

[25] 陈兵，文建凡. 内含子在生物信息学研究和基因工程中的应用[J]. 生命的化学，2010，30（1）：59－63.

[26] ROY S W，PENNY D. Patterns of intron loss and gain in plants: intron loss-dominated evolution and genome-wide comparison of O. sativa and A. thaliana[J]. Mol Biol Evolut，2007，24（1）：171－181.

[27] 金谷雷. 内含子进化模式研究[D]. 福州：福建农林大学，2007，29－32.

[28] 张尚宏，屈良鹄. 基因组的进化与内含子中的基因的进化[J]. 中山大学学报，1999，38（1）：50－52.

[29] 靳霞，吕占军. 内含子的进化及基因表达调节[J]. 生命的化学，2008，28（1）：33－35.