温针灸对吗啡戒断大鼠NR2B受体表达影响的研究*

卫 哲，董 哲，孙远征，尚 颖

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001;2.哈尔滨市儿童医院，黑龙江哈尔滨150010)

目前，吗啡依赖和戒断的机制已成为国内外众多学者研究的热点和难点。药物反复滥用会影响机体学习记忆能力，NR2B作为NMDA受体的主要亚基之一，其高表达的转基因小鼠具有超常的学习记忆能力，在行为学测试中表现出良好的学习记忆能力，有学者认为NR2B与大脑的认知密切相关，从而将NR2B命名为“聪明基因”[1]。而NR2B蛋白在吗啡和自然奖赏条件位置偏爱的学习中亦发挥着重要作用[2]。研究表明，药物成瘾的慢性过程可以导致脑功能的长时程变化，引起中枢突触可塑性的变化，多种学习记忆系统参与其中，多巴胺、谷氨酸等相对独立又互相关联的神经递质系统共同参与成瘾行为的学习记忆调控过程，对记忆产生正向或反向的影响，调节着记忆的巩固。本研究通过温针灸对NR2B受体表达的影响，从而分析吗啡戒断后大鼠的空间学习能力的中枢作用机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

选择由黑龙江中医药大学实验动物中心提供的雄性SD大鼠40只，体重为(190±30)g。实验前进行适应性喂养1周，房间温度、湿度分别在 22℃、75%左右。

1.2 实验试剂

兔抗多克隆一抗(武汉博士德生物工程有限公司);二抗PV6001(北京中山生物工程有限公司);盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药厂)。

1.3 主要仪器与设备

MT－200Morris水迷宫视频跟踪分析系统、KWD808Ⅱ脉冲治疗仪、moticam3000显微摄影成像系统等。

2 实验方法

2.1 实验分组

采用transform随机分组方法，将40只大鼠分为对照组、模型组、手针组、温针灸组，每组各10只。

2.2 造模方法

对模型组、手针组、温针灸组大鼠均采用逐日递增法背部皮下注射盐酸吗啡注射液，5天的剂量分别为(20 mg/kg，30 mg/kg，40 mg/kg，50 mg/kg，50 mg/kg)，2次/天(8 am，4 pm)。对照组以相同剂量、相同时间注射生理盐水。吗啡末次注射后3 h给予纳络酮腹腔注射(3 mg/kg)快速戒断，随即将大鼠置于3000 ml烧杯中，观察10 min内大鼠的跳跃、舔阴、竖立、湿抖、洗脸等戒断反应，建立吗啡依赖戒断大鼠模型[3～4]。评分标准见表 1。

表1 戒断症状评分标准

2.3 各组处理

对照组:第6天开始同温针灸组以相同方法固定。

模型组:按上述方法造模，第6天开始同温针灸组以相同方法固定。

温针灸组:第6天开始予温针灸治疗，取百会、双侧肾俞，针刺得气后，在针尾上搓捏少许艾绒点燃施灸，只待燃尽，除去灰烬，留针稍许再将针拔出，共计留针15 min，连续6天。

手针组:第6天开始予针刺治疗，选穴方法同温针灸组，15次/min，1次/天，连续6天。

2.4 灌注取材

治疗结束后各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠，麻醉后开胸，于右心房和左心室心尖部各做一切口，进行主动脉插管快速灌注冲洗液 200 ～250 ml[5]，开颅，完整取出全脑组织，分离Nac脑区，液氮保存。

2.5 免疫组化PV二步法

①切片常规脱蜡到水; ②3% H2O2中孵育10 min，PBS 冲洗2 min3 次; ③微波修复; ④滴加一抗，4℃冰箱中过夜，PBS 冲洗2 min3 次; ⑤滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS 冲洗2 min3 次; ⑥DAB 显色5 ～ 10 min，蒸馏水充分冲洗; ⑦苏木素复染1 min; ⑧常规脱水透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

2.6 结果观察方法

moticam3000显微摄影成像系统于400倍视野下摄影，每组随机选取10个视野，用Motic image 3.2图像分析软件进行分析，计算平均光密度。阳性表达呈黄色或棕黄色。

2.7 统计学处理

由SPSS16.0统计软件包进行数据处理。以P＜0.05为有统计学意义。

3 实验结果

3.1 吗啡戒断大鼠行为学观察

大鼠戒断症状评分，见表2。表2结果显示，除对照组外，模型组、温针灸组、手针组大鼠经快速戒断后出现站立、激惹、齿颤等一系列戒断症状，戒断症状的评分值明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明动物模型建立成功。

表2 吗啡戒断大鼠症状观察(±s)

表2 吗啡戒断大鼠症状观察(±s)

注:与对照组相比，△P ＜0.05。

0.3 ±0.48模型组 20.5 ±4.16△温针灸组 18.5 ±3.78△手针组 21.41 ±5.59组别 戒断症状评分值对照组△

3.2 Morris水迷宫测试结果

吗啡戒断后大鼠的MWM迷宫测试结果，见表3。表3结果显示，与模型组比较，温针灸组、手针组的平均潜伏期明显缩短，有非常显著性统计学差异(P＜0.01)，提示其空间学习能力明显改善;与手针组比较，温针灸组的平均潜伏期明显缩短，有显著性统计学差异(P＜0.05)，提示温针灸组在改善戒断大鼠空间学习能力方面优于手针组。

表3 吗啡戒断后不同组别大鼠MWM迷宫测试(±s)

表3 吗啡戒断后不同组别大鼠MWM迷宫测试(±s)

注:与对照组比较，▲P＜0.01;与模型组比较，☆P＜0.01;与温针灸组比较，●P ＜0.05。

组别 例数(只)平均潜伏期(s)第3天 第4天 第5天对照组 10 12.50 ±3.38☆ 11.12±2.80☆ 8.87 ±3.48☆模型组 10 50.12 ±6.79▲ 46.00 ±4.53▲ 43.25 ±6.52温针灸组 10 27.2 ±10.18▲☆ 25.84 ±11.21▲☆ 24.5 ±9.72▲☆手针组 10 32.7 ±11.23▲☆● 29.37 ±10.76▲☆● 7.02 ±9.96▲☆●

3.3 NMDA－NR2B受体表达的变化

不同的方法治疗6天后，吗啡戒断大鼠NAc脑区NMDA－NR2B受体在神经元细胞质中阳性表达(阳性染色细胞的平均光密度)，见表4所示。

表4 各组大鼠脑区NMDA－NR2B受体表达的影响(±s)

表4 各组大鼠脑区NMDA－NR2B受体表达的影响(±s)

注:与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与对照组比较，◆P ＜0.05，◆◆P ＜0.01。

NAc对照组 10 0.142 ±0.01组别 n△△模型组 10 0.104 ±0.01◆◆温针灸组 10 0.135 ±0.01△△◆手针组 10 0.128 ±0.001△△◆

表4结果显示，与对照组比较，模型组、温针灸组、手针组NAc脑区的NMDA－NR2B受体表达有显著性差异(P＜0.01)，表明吗啡戒断后大鼠NAc脑区NMDA－NR2B受体表达降低。与对照组比较，温针灸组大鼠NAc脑区的NMDA－NR2B受体表达有显著性差异(P＜0.05)。与模型组比较，温针灸组、手针组NAc脑区的NMDA－NR2B受体表达有非常显著性差异(P＜0.01)，表明针刺可以增高吗啡成瘾戒断后大鼠NAc脑区NMDA－NR2B受体表达，推测与改善戒断后大鼠的学习记忆能力有关。

4 讨论

本实验以逐日递增法、快速戒断法建立吗啡依赖戒断SD大鼠模型，实验结果显示，温针灸可以明显缩短大鼠Morris水迷宫平均潜伏期(P＜0.01)，调整大鼠NAc脑区的NMDA－NR2B受体表达(P＜0.01)，认为其可以改善吗啡戒断大鼠空间学习能力。

Morris水迷宫(Moms Water Maze，MWM)是目前国际通用的空间辨别学习记忆模型，用来评定大鼠的空间学习能力。其操作简单，数据可靠，在精神科及神经科领域得到了比较广泛的应用。目前，检测大鼠记忆力的Morris水迷宫的指标有很多，包括有定位航行实验、空间探索实验等等，其中最常用的评价指标是定位航行实验中的指标——“逃避潜伏期”[6]。在定位航行实验中多次训练大鼠寻找站台可以提高大鼠的空间学习能力[7]。罗小泉等[8]研究发现，不同的入水象限，不同的入水次序对Morris水迷宫的检测大鼠记忆力都有影响。

温针灸是针刺与艾灸结合使用的一种方法，具有温通经脉、行气活血的作用。中医学认为，阿片类物质成瘾后戒断综合征主要以肝、脾、肾三脏阴液不足、阴虚火旺为根本病机改变[5]。温针灸能够以温热效应促使机体气血周身流动，滋阴温阳，促进机体阴阳平衡，使戒断症状得到抑制，从而起到戒断毒瘾的作用。目前，对于吗啡成瘾后戒断综合征多侧重于电针、艾灸单一穴位的实验研究，很少有关于温针灸对于吗啡成瘾戒断后症状作用的研究。

本研究鉴于中脑边缘多巴胺系统在药物依赖形成中所起的重要作用，并基于大脑内NAc多巴胺系统为药物成瘾的神经生物学基础以及药物戒断后脑内Glu受体表达的改变，从NR2B受体角度分析温针灸对吗啡成瘾戒断后空间学习能力的影响机制，为针灸治疗吗啡成瘾戒断症状的临床推广提供新的理论依据。对于针灸戒毒的研究还应加强针灸手法、穴位配伍、针灸时机等不同影响因素的技术研究，进而评价针灸戒毒的效果，以便更好的指导临床。

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[4]胡华，余会平，蒙华庆，等.吗啡依赖大鼠脑超微结构及其Bcl－2表达研究[J].现代预防医学，2010，37(16):3114 －3117

[5]孙远征，卫哲，马俊，王明明.荧光定量PCR法检测电针对吗啡戒断后大鼠脑组织CREBmRNA表达的影响[J].医学信息，2011，24(1):271－272

[6]陈罗西，郭玲玲，李亮.Morris圆形水迷宫的应用及其相关检测指标分析[J].辽宁中医药大学学报，2008，10(8):55

[7]郑红，王文，刘渝，等.重复Morris水迷宫训练提高大鼠空间学习能力却不影响空间记忆能力[J].神解剖学杂志，2007，23(6):599

[8]罗小泉，骆利平，陈海芳，等.Morris水迷宫检测大鼠记忆力方法的探讨[J].时珍国医国药，2010，21(10):2667 －2669