锦鲤疱疹病毒CJ株ORF25基因的克隆及生物信息学分析

周井祥，李新伟，朱 霞，王 好，吕文亮

(吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，长春 130118)

锦鲤疱疹病毒病(Kio herpesvirus disease，KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus，KHV)引起锦鲤、鲤鱼及其普通变种如框镜鲤等发病的一种具有高度传染性和致死性的疾病。

该病于1998年首次在以色列的Magan Michael地区和美国爆发[1]，其后迅速传播至英国、德国、比利时和印度尼西亚等国，2002年中国广东省锦鲤疑似发生本病[2]，其后该病在我国频繁爆发，给鲤鱼养殖业带来了几乎毁灭性的打击。

KHV是线形双股DNA病毒，是鱼类疱疹病毒属中基因组最大的病毒[3]。它有156个开放性阅读框(ORF)，其中只有少数已经确定其功能。ORF25和ORF99编码膜糖蛋白，主要在细胞质中表达[4]。

目前国内还没有有效的控制KHV的方法，本研究以吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室在国内首次分离到的锦鲤疱疹病毒吉林株(KHV-CJ)基因组为模板，成功克隆到KHV糖蛋白-ORF25基因，并分析其生物学信息，旨在为进一步研究锦鲤疱疹病毒的基因背景信息及基因工程疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与病毒 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)由吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室分离保存[5];框镜鲤尾鳍原代细胞由吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室繁殖保存。

密斯·凡德罗（Ludwig Mies·Van der Rohe,1886～1969）提出了“少则多”（Lessis more）的设计原则，所谓“少”是针对当时建筑界流行的古典装饰手法提出的，而“多”则指的是大工业条件下形式简洁而功能丰富的建筑。该设计观念最初是为了追求所谓的单纯建筑，引起了极大的争议，但深远地影响了 20 世纪以来从事各个领域的设计师、设计教育，他可以说是 20 世纪对于世界设计影响最大的一个人物。

1.2 菌株与载体 pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司，E．coli DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 主要试剂 新生牛血清、M199培养基为Invitrogen公司产品;Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅤ和EcoRⅠ、DNA Marker等购自大连宝生物工程有限公司;凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自天根生化有限公司。

（一）认知周边一些常见物的性质、组成、以及该物质在生活当中的实际应用；形成基础的化学概念，能对事物的微观构成加以认知，并了解物质用途和物质性质间的关系，能自行的设计、完成基础性的化学实验。

1.4 引物的设计及合成 根据GenBank上登录的锦鲤疱疹病毒 ORF25基因序列，利用 Primer Premiers 5.0软件设计1对引物，上游引物:P1 5'-GATATCATGACGGGTTGTGGGGTT-3'，下游引物:P2 5'-GAATTCTTAGGGCCTCCGGGA-3'，分别引入EcoRⅤ和EcoRⅠ限制性酶切位点(划线部位)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的PCR扩增 按照Hasegawa等[6]和Neukirch等[7]的方法培养细胞。将KHV-CJ病毒液接种框镜鲤尾鳍原代细胞(MFC)单层，收集病毒后提取病毒DNA，采用25 μL反应体系进行PCR扩增，反应条件如下:95℃预变性5 min，94℃ 40 s，59.3℃30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环。

1.6 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的克隆及鉴定 将目的片段纯化回收后，与pMD18-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞，氨苄青霉素筛选单菌落，提取重组质粒后以EcoRⅤ和EcoRⅠ双酶切鉴定阳性重组质粒，命名为pMD18-T-25，送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

2.3.2 疏水性分析 通过ProtScale在线分析，ORF25的最大疏水指数为3.056，最小疏水指数为-3.067，其疏水性分析结果如图3所示。

2.1 框镜鲤尾鳍原代细胞(MFC)接种KHV后细胞病变 MFC接种KHV后，5～6 d出现细胞体积增大及少量的细胞空泡化，10 d后病变更加明显，且细胞开始从瓶壁脱落(图1)。

2 结果

1.8 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的系统进化树分析 从GenBank上分别下载锦鲤疱疹病毒日本株、美国株和以色列株的基因序列，利用DNAStar6.0(MegAligen)构建不同锦鲤疱疹病毒株的ORF25基因进化树，分析其进化关系。

“电力系统继电保护”是由多门学科交叉的一门专业课，具体涉及电路原理、高等数学、电力电子、电机学等知识。课程的教学目的在于使学生掌握继电保护原理以及分析方法，能够熟练应用多种继电保护装置，从而解决在实际工程中的继电保护问题。

2.2 ORF25基因的PCR扩增和鉴定 PCR扩增出一条与目的片段大小相符的DNA片段(图2)，pMD18-T-25用EcoRⅤ和EcoRⅠ进行双酶切，获得一段约1824 bp的片段(图2)，说明ORF25基因片段已成功克隆至载体中。

2.3 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的生物信息学分析

2.3.1 基因的序列测定和编码蛋白分子特征 测序结果表明，ORF25基因长1824 bp，为一完整的开放阅读框，编码608个氨基酸，预测ORF25基因的理论分子质量为66825.44 Da，等电点为7.947。

1.7 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25基因编码蛋白的生物信息学分析 利用DNAStar软件翻译出 ORF25基因的核苷酸序列;利用ProtScale(http://www.expasy.ch/tools/protscale.html)软件分析蛋白的疏水性;利用BepiPred1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)软件和DNAStar6.0(Protean)对ORF25序列编码的蛋白进行抗原表位分析;分别利用 NetNGlyc1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和YinOYang1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/)在线分析软件进行N-糖基化位点和O-糖基化位点预测，利用 NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)进行磷酸化位点预测。

图3 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25编码蛋白的疏水性分析

2.3.4 糖基化及磷酸化位点的预测 分别通过NetNGlyc1.0在线分析软件和YinOYang1.2在线分析软件对锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25进行N-糖基化位点和O-糖基化位点预测。结果表明，其氨基酸序列存在6个潜在的N-糖基化位点、25个潜在的 O-糖基化位点。用NetPhos2.0在线分析软件对锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25进行磷酸化位点进行预测，结果显示，当阈值取0.5时，其氨基酸存在28个潜在的磷酸化位点。

（3）砍树。现状部分渠段渠道开口处种植有杨树，在工程施工时需对施工有影响的树进行砍伐。根据现场调查，本工程共伐树1700株，其中胸径小于15cm的有1379株，胸径大于15cm且小于30cm的有321株。

图4 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的抗原表位分析

2.3.3 抗原表位分析 用http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/在线软件及 DNAStar 6.0(Protean)对锦鲤疱疹病毒ORF25基因编码的蛋白进行抗原表位分析，得出其抗原表位主要集中在第61～69、78 ～87、109 ～136、164 ～174、179 ～196、219～257、273 ～291、357 ～372、385 ～390、476 ～524、527～573、578～606位氨基酸(图4)。

重要性;认真落实交接班制度,做到床旁交接,护士长不定时晨会提问在班护士高风险患者;每周进行2次安全检查,包括门窗设施、保护性用具、患者用物等[5]。

2.4 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的系统进化树分析 从GenBank上分别下载锦鲤疱疹病毒日本株(KHV-J)、美国株(KHV-U)和以色列株(KHV-I)的ORF25基因，和本中国吉林株(KHV-CJ)ORF25基因构建了分子进化树(图5)。结果显示，KHV-CJ与KHV-U处于一个分支，与KHV-U进化关系稍近，与KHV-I进化关系最远。

2011-2015年，台湾对大陆农耕产品贸易总值中所占份额较大的产品主要有谷类及其制品、水果、坚果及其制品、砂糖及其制品、茶叶及其制品、酒类、植物油和其他农耕产品；大部分农耕产品的出口值逐年增加，尤其是谷类及其制品、水果、坚果及其制品和其他农耕产品(见图1)。

图5 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的系统进化树

3 讨论

锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒(KHV)引起锦鲤(Cyprinus carpio koi)和鲤鱼(Cyprinus carpio)发病的一种高致病性疾病。该病多发生在水温为18～28℃的春秋季节，具有高度传染性，发病率和死亡率均可高达80% ～100%[4]。目前，锦鲤疱疹病毒病已在多国爆发，造成了巨大的经济损失。

本实验成功获得了长1824 bp的ORF25基因。生物信息学分析表明其表达产物抗原性良好，其氨基酸序列存在6个潜在的N-糖基化位点、25个潜在的O-糖基化位点以及28个潜在的磷酸化位点。糖基化是真核生物蛋白质翻译前或翻译后的一个重要修饰过程，并可提高蛋白基因组的多样性[8]，其中N-糖基化作用位点与抗原性和免疫原性有关[9]。蛋白磷酸化是一种蛋白翻译后的修饰作用，由蛋白激酶执行。磷酸化在多种真核细胞的生命活动中具有重要作用，例如保证有丝分裂 /细胞周期[10]、新陈代谢[10]以及信号转导[11]的正常运行。

系统进化树分析表明，锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25基因与美国株的进化关系最近，同源性为99%。

城乡规划中的农村景观设计应遵循相应的原则，提高城乡规划的整体质量。为了遵循协调的原则，城乡规划中的农村景观设计具有不同的内容类型，需要根据当地地形和景观进行规划和设计，生态保护的要求和历史文化的特点.结合农村景观与园林景观的设计规划，提高了农村景观要素与内容的和谐统一，促进了农村景观的良好发展。农村景观与园林景观的结合，规划中地理特征的鲜明表现，区域文化的灵活融合和规划设计的历史发展，对提高城乡规划的整体质量具有催化作用。

本研究在国内首次选用KHV的糖蛋白基因-ORF25基因作为目的基因，以在我国分离到的锦鲤疱疹病毒中国吉林株的DNA作为模板，成功将其克隆，并采用生物信息学方法对其结构和功能进行了分析，为进一步研究锦鲤疱疹病毒的基因背景信息及基因工程疫苗奠定了基础。

[1]Hedrick R P，Gilad O，Yun S，et al.A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi，a strain of common carp[J].Journal of Aquatic Animal Health，2000，12(1):44-57.

[2]刘 荭，史秀杰，高隆英，等.进口锦鲤杯发病病原的nested-PCR 鉴定[J].华中农业大学学报，2002，21(5):414-418.

[3]Pikarsky E，Ronen A，Abramowitz J，et al.Pathogenesis of acute viral disease induced in fish by carp interstitial nephritis and gill necrosis virus[J].J Virol，2004，78:9544-9551.

[4]朱 霞，王 好，李新伟，等.锦鲤疱疹病毒病的研究进展[J].中国兽医科学，2011，41(1):106-110.

[5]朱 霞，李新伟，王 好，等.一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报，2011，33(5):340-343.

[6]Hasegawa S，Somamoto T，Nakayasu C，et al.A cell line(CFK)from fin of isogeneic ginbuna crusian carp[J].Fish Pathol，1997，32:127-128.

[7]Neukirch M，Bottcher K，Bunnajirakul S.Isolation of a virus from koi with altered gills[J].Bull Eur Assoc Fish Pathol，1999，19:221-224.

[8]Weerapana E，Imperiali B.Asparagin e linked protein glycosylation:from eu karyotic to prokaryotic systems[J].G Ycob ology，2006，16(6):91R-101R.

[9]Gunn P，Sato F，Powell K，et al.Rotavirus neutralizing protein VP7:antigenic determinants investigated by sequence analysis and peptide synthesis[J].J Virol，1985，54(3):791-797.

[10]Lou Y，Yao J，Zereshki A，et al.NEK2A interacts with MAD1 and possibly functions as a novel integrator of the spindle checkpoint signaling[J].J Biol Chem，2004，279:20049-20057.

[11]Meijer A J，Dubbelhuis P F.Amino acid signalling and the integration of metabolism[J].Biochem Biophys Res Commun，2004，313:397-403.