芩花注射剂的制备工艺及主药含量测定

刘 挺，李继昌，蒋国政，韩振兴

(东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030)

芩花注射剂主要用于防治猪支原体感染。它以黄芩和金银花为主药，黄芩具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效[1];金银花为常用的清热解毒药，含有绿原酸、异绿原酸、木犀草素、芳樟醇等，主要成分绿原酸具有明显的抑菌作用。中药提取方法有水提碱溶液法、水提石硫醇沉淀、碱醇胶冻法、醇提水沉酸化法、脱脂醇提法、超声提取法、超滤法、树脂吸附法、分级提取法、微波提取法和水提取醇沉淀法等[2-5]。本试验采取水提醇沉法提取中药有效成分，确定最佳制备工艺，并采用HPLC法进行绿原酸、黄芩苷的含量测定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Waters E2695高效液相色谱仪、Waters 2998二极管检测器由美国Waters公司生产;Hypersil BDS C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)由大连依利特分析仪器有限公司提供。

1.1.2 药物与试剂 黄芩、金银花、百部等中药材购于黑龙江省药材公司，黄芩苷对照品(CAS NO:21967-41-9)、绿原酸对照品(CAS NO:327-97-9)购于中国药品生物制品检定所。甲醇为色谱纯，吐温-80、苯甲醇、冰醋酸为分析纯。

1.2 芩花注射剂的制备工艺

1.2.1 单因素试验

1.2.1.1 提取次数对提取量的影响 取5份等量的药粉(每份药粉含有黄芩、金银花、百部、甘草、紫菀)，固定每次提取时间为1 h，料液比为1∶10，分别浸提1次、2次、3次、4次、5次，记录黄芩苷和绿原酸的提取量。

1.2.1.2 提取时间/次对提取量的影响 取5份等量的药粉，固定提取次数为2次，料液比1∶10，每次提取时间分别取 0.5、1、1.5、2、2.5 h，记录黄芩苷和绿原酸的提取量。

1.2.1.3 料液比对提取量的影响 取5份等量的药粉，固定提取时间1 h，提取2次，分别以料液比为1 ∶8、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25 提取，记录黄芩苷和绿原酸的提取量。

1.2.2 正交试验 主药的有效成分为黄芩苷和绿原酸，由于绿原酸提取量较低，而黄芩苷提取量相对较高，因此以绿原酸提取量确定正交试验结果。正交设计L4(23)因素水平如表1所示。

表1 中药提取工艺因素水平正交设计L4(23)表

1.2.3 注射剂制备流程 药物提取→70%酒精醇沉置于4℃冰箱24 h→抽滤浓缩→90%酒精醇沉置于4℃冰箱24 h→抽滤浓缩至无醇味→定容使每毫升药液含1 g生药→pH调至8.5→0.5%活性炭煮沸30 s→抽滤→加入0.5%吐温-80、1%苯甲醇、0.1%硫代硫酸钠等附加剂→pH调至8.5→0.22 μm滤器过滤封装→流通蒸汽灭菌。

1.3 主药含量测定

1.3.1 色谱条件 流动相为甲醇(A)-1%冰醋酸(C)(A+C=100%)，等度洗脱，黄芩苷测定中A ∶C=50 ∶50，吸收波长 276 nm，流速 1 mL/min，进样量10 μL;绿原酸测定中A ∶C=20∶80，吸收波长330 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL。

1.3.2 溶液的制备

1.3.2.1 对照溶液的制备 精密称取3.2 mg黄芩苷对照品，用50%甲醇定容于25 mL容量瓶中，并分别配制成浓度为 12.8、25.6、38.4、51.2、64 μg/mL的对照品母液。精密称取4.8 mg绿原酸对照品，用50%甲醇定容于25 mL容量瓶中，分别配制成浓度为 19.2、38.4、57.6、76.8、96 μg/mL 的对照品母液。

1.3.2.2 供试品溶液的制备 精密吸取0.5 mL自制芩花注射液，用50%甲醇定容于50 mL容量瓶中，作为绿原酸供试品。精密吸取5 mL自制芩花注射液，用50%甲醇定容于10 mL容量瓶中，作为黄芩苷供试品。供试品进样前用0.45 μm微孔滤膜过滤。

1.3.3 线性关系考察 分别取系列浓度的黄芩苷和绿原酸对照品母液，在A∶C=50∶50和A∶C=20∶80条件下进样测定，记录色谱图。

1.3.4 精密度试验 精密吸取黄芩苷、绿原酸对照品溶液注入液相色谱仪，连续进样5次，测定峰面积。

1.3.5 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、24 h 进样，测定样品中黄芩苷、绿原酸的峰面积。

1.3.6 重复性试验 精密称取同一批号5份样品，按供试品溶液制备方法制备进样，记录峰面积。

1.3.7 加样回收率 取2.5 mL自制芩花注射液，用50%甲醇定容于50 mL容量瓶中(测得药液浓度28.654 μg/mL)，分别精密吸取1～5 mL该药液于5支10 mL容量瓶中，再取5份浓度为64 μg/mL黄芩苷对照品2 mL，分别加入以上5支容量瓶中并定容，作为黄芩苷回收率样品。精密吸取芩花注射液0.5 mL，用50%甲醇定容于50 mL容量瓶中(测得药液浓度30.974 μg/mL)，精密吸取该药液3～7 mL于5支10 mL容量瓶中，再取5份浓度为76.8 μg/mL绿原酸对照品2 mL分别加入以上5支容量瓶中并定容，作为绿原酸回收率样品。分别取10 μL过膜后进样测定，计算回收率。

1.3.8 样品含量测定 按照黄芩苷和绿原酸的色谱条件，对黄芩苷和绿原酸供试品进行依次测定。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取次数对提取量的影响 结果见图1，可见提取2次时的主药含量与多次提取的已无显著差别，因此选定提取次数为1次和2次进行正交试验较为方便。

图1 提取次数对提取量的影响

2.1.2 提取时间/次对提取量的影响 结果见图2，显示提取时间为1 h含量较高，故以1 h和1.5 h作为正交试验因素。

图2 提取时间对提取量的影响

2.1.3 料液比对提取量的影响 结果见图3，显示10倍量水和15倍量水主药量各有不同，含量较为接近，由于后期制备注射剂过程中浓缩较麻烦，为方便制备，选择8倍量水和10倍量水进行正交试验。

图3 料液比对提取量的影响

2.2 正交试验结果 正交实验结果见表2，经统计分析可知，对绿原酸含量影响大小的因素依次为B＞A＞C，最佳组合为A1B2C2，即采用10倍水量、煎煮2次、每次1 h的提取方式较好。

表2 正交试验结果

2.3 主药含量测定

2.3.1 线性关系考察 以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归，得黄芩苷与绿原酸的回归方程分别为 Y=0．04X-14．78(r2=0．999)，Y=0．04X-10．73(r2=0．998);分别在 12.80 ～64.00、19.20～96.00 μg/mL 浓度范围内呈良好线形关系。

2.3.2 精密度试验 测得黄芩苷峰面积RSD=0．28%，绿原酸峰面积RSD=0.43%，表明所选方法精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 测得样品中黄芩苷、绿原酸的峰面积:黄芩苷 RSD=1．48%，绿原酸 RSD=2.19%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 重复性试验 经测，黄芩苷RSD=2．94%，绿原酸RSD=2.62%，表明方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率测定 黄芩苷和绿原酸的平均加样回收率分别为103.13%和100.37%。

2.3.6 样品含量测定 芩花注射液样品中黄芩苷和绿原酸的含量分别为3.292、0.860 mg/mL。

3 讨论与结论

中药注射剂是近30年发展起来的一种新型制剂，它的确切疗效已经为临床所证实[6-7]。芩花注射剂在药物提取过程中采用水提醇沉的方法，该方法方便、价格低廉。利用单因素试验筛选出正交试验的因素和水平，通过正交试验的方法，以绿原酸提取量为依据确定了煎煮的条件。按照药典中注射剂质量标准，注射剂中不能存在鞣质、树脂、蛋白质等物质，在醇沉浓度90%时符合该标准，将杂质均除去，但对药物含量有一些影响。由于药物提取完成后，高温会对药物成分有影响，因此使用活性炭吸附杂质时，煮沸时间定为30 s到1 min为宜，最后药液pH调节至8.5时澄清度最佳，此时黄芩苷溶解度较好。附加剂的添加起到了抗菌、抗氧化、助溶及止疼的作用。采用现代制剂的新技术和新方法，选择药理活性强、毒副作用小的传统中药处方将其制成中药注射剂，并制定严格的质量控制方法，可以使其达到安全、有效、稳定、可控的标准，有效发挥中药防病治病的作用[8]。采用液相色谱法测定药物含量方便快捷。

[1]宋立人，洪 恂，丁绪亮，等.现代中药学大辞典[M].北京:人民卫生出版社，2001:1865-1869.

[2]李玉山.黄芩的化学成分及黄芩苷的提取方法[J].西北药学杂志，2008，23(6):410-411.

[3]肖崇厚.中药化学[M].上海:上海科学技术出社，1987:327-328.

[4]CHI Ru-an，ZHOU Fang，HUANG Kun，et al.Separation of bacalinfrom scutellaria baicalensis Georgi with polyamide[J].J Cent South Univ Technol，2008，15:606-611.

[5]赵新先.中药注射剂学[M].广州:广东科技出版社，2000:569.

[6]叶时英，李认书，黄水雅.中药注射剂发展现状及开发思路探讨[J].中国中医药信息杂志，2004，11(9):823-833.

[7]张 方，黄泰康.复杂性科学视野下的中药现代化研究[J].中草药，2005，36(6):951-954.

[8]张晓红.中药注射剂安全性分析[J].中国药师，2007，10(11):1135-1137.