5－羟色胺转载体抑制剂对肺动脉高压肉鸡肺组织胶原蛋白含量的影响

元晓琪，潘家强，李 英，韩前彪，朱余军，韩文彩

（华南农业大学兽医学院，广东 广州510642）

肉鸡肺动脉高压综合征（pulmonary hypertension syndrome，PHS），是由于各种原因导致肺动脉系统阻力增加，血管变应性降低，致使肺血管血压升高从而导致一系列病理变化的疾病［1］，最显著的临床特征为右心室肥大、扩张，腹腔积液，是严重危害肉鸡养殖业的一种疾病。5－羟色胺（5－HT）作为一种缩血管活性物质和促增值因子，在PHS发生中的作用已经得到了证实［2］。5－HT能通过5－羟色胺转载体（SERT）介导，促进肺动脉平滑肌细胞增殖，从而参与肺血管重构的过程［3］。5－羟色胺转载体抑制剂已被证明能够抑制肉鸡肺血管重构，降低PHS的发病率，并且这一作用与5－HT介导的肺动脉平滑肌细胞增值有关［4］。肺动脉高压时肺血管结构变化除了平滑肌细胞增殖外，尚有外膜成纤维细胞的增殖，及结缔组织的沉积，沉积的结缔组织成分主要是胶原蛋白和弹性蛋白［5］。在人类肺动脉高压发生的过程中，肺成纤维细胞通过增殖、转化为肌成纤维细胞，向中膜和新生内膜迁移、增殖，并大量分泌细胞外基质（主要为胶原蛋白），引起肺血管重构［6］。SERT是否对PHS肉鸡肺成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质产生影响，进而影响肺血管重构值得进一步研究。

1 材料与方法

1.1 试验动物 1日龄科宝肉鸡160羽，购自深圳某孵化场。

1.2 试验动物的饲养和分组 160羽科宝肉鸡购入后常规饲养两周，14日龄时随机分为4组，即A组：正常对照组，按常规饲养。B组：发病组，参照本实验室建立的方法［7］，在21日龄通过翅静脉注射CM－32纤维素颗粒（Whatman公司），诱发PHS。C组：西酞普兰治疗组，自18日龄起，按10mg／kg·d剂量灌喂西酞普兰，在21日龄通过翅静脉注射CM－32纤维素颗粒诱发PHS。D组：氟西汀治疗组，自18日龄起，按10mg／kg·d剂量灌喂氟西汀，在21日龄通过翅静脉注射CM－32纤维素颗粒诱发PHS。至42日龄试验结束。试验过程中统计各组发病率，并分别于19、22、35日龄及42日龄每组随机抽取5羽肉鸡，同一部位采集肺脏组织各两管，置于－80℃冰箱保存，1份待测羟脯氨酸含量，1份用ELISA方法测量5－HT浓度。

1.3 肺组织羟脯氨酸含量测定 参照徐铮等学者的方法［8］，以羟脯氨酸含量反映胶原蛋白含量。

1.3.1 标准曲线的制备 用2mL双蒸水作为空白对照，然后用2mL标准羟脯氨酸溶液（25μg／mL）作倍比稀释，浓度依次为25μg／mL、12.5μg／mL、6.25μg／mL、3.13μg／mL、1.56μg／mL、0.78 μg／mL。加入1mL 0.1mol／L的柠檬酸缓冲液（pH 值6.0）和1mL 0.05mol／L氯胺－T 溶液，37℃恒温箱中保温30min。加入3.15mol／L高氯酸溶液1mL，混匀，室温作用5min终止氧化。加入10%的对二甲氨基苯甲醛溶液1mL，混匀，放入75℃水浴锅中水浴10min显色后，用分光光度计560nm读取各管吸光度，绘制标准曲线。

1.3.2 肺组织羟脯氨酸测定 肺脏样品取出解冻，称重，剪碎匀浆。加入1mL 0.5%胃蛋白酶溶液，混匀，移入10mL具塞试管，37℃保温3h。加入5 mL 6mol／L盐酸，80℃恒温箱中酸解24h。过滤沉渣，取2mL放入带刻度试管，10%NaOH调pH值到6.0，双蒸水补足到8mL。取2mL于新试管中，依次加入0.1mol／L的 柠檬酸缓冲液和0.05 mol／L氯胺－T溶液各1mL，37℃恒温箱中保温30min。加入3.15mol／L高氯酸溶液1mL，混匀，室温作用5min终止氧化。加入10%对二甲氨基苯甲醛溶液1mL，混匀，80℃水浴恒温箱中放置10 min显色。分光光度计560nm测定吸光度，将测定结果代入标准曲线，计算羟脯氨酸浓度，以羟脯氨酸浓度与所取肺组织质量的比值作为羟脯氨酸相对含量。

1.4 肺组织5－HT含量 采用鸡5－HT定量检测试剂盒（ELISA）测定（RB公司生产）。参考孙程程等提到的方法［9］，取1g左右肺脏组织，称重，冰面上剪碎匀浆，加入1mL 0.2mol／L高氯酸溶液，10 000 r／min（4℃）离心10min。提取上清液，加入硼酸盐缓冲溶液（pH值＝9.25）1mL，10 000r／min（4℃）离心5min。将上清液移入新管，确保无沉淀残留，4℃存放待测。标准曲线的制备及样品测定方式参考使用说明书，使用酶标定量测定仪于450nm处测定吸光度，代入标准曲线，求出5－HT浓度。

1.5 数据分析 数据以平均值±标准差表示，用SPSS 18软件统计各组数据之间的差异显著性。

2 结果及分析

2.1 发病率比较 正常对照组有2羽肉鸡出现PHS典型临床症状，发病率为5%，发病组有14羽出现临床症状，发病率为35%，经SPSS卡方检验，2组间差异极显著。同时C组发病4羽，发病率10%，D组有5羽出现临床症状，发病率为12.5%，经统计与正常对照组差异均不显著，而与发病组差异均显著。

2.2 各组肉鸡肺脏羟脯氨酸含量测定结果 静脉注射纤维素颗粒15日后，即试验肉鸡35日龄及42日龄，发病组肉鸡肺脏羟脯氨酸含量比正常对照组显著增高，表明胶原蛋白含量上升，成纤维细胞转化，合成活跃。同时，灌喂SERT抑制剂氟西汀、西酞普兰的肉鸡肺组织羟脯氨酸含量显著低于发病组，与对照组差异不显著，暗示抑制5－HT活性能降低发病肉鸡肺组织胶原蛋白含量，这可能是通过减弱成纤维细胞合成胶原蛋白实现见表1。

2.3 各组肉鸡肺组织5－HT含量测定结果 结果如表2。静脉注射纤维素颗粒2d后，即试验肉鸡22日龄时，发病组5－HT含量显著高于正常对照组和两个治疗组。在35日龄和42日龄时，发病组5－HT含量依然高于正常对照组和两个治疗组，而氟西汀和西酞普兰治疗组与正常对照组差异不显著。提示发病组肉鸡肺脏5－HT含量升高，而灌喂SERT抑制剂氟西汀和西酞普兰能降低发病肉鸡肺组织5－HT含量。

表1 各组肉鸡肺脏羟脯氨酸含量比较（%）

表2 各组肉鸡肺脏5－羟色胺含量比较（pg／mg）

3 讨论

关于肉鸡PHS的发病机理，学界进行了各种各样深入的研究，其中肺血管重构在PHS发病过程中的作用已得到证实。5－HT能够通过SERT促进肺动脉平滑肌细胞增殖，而后者作为血管重要细胞结构，其增殖正是肺血管重构的基础。潘家强等学者的研究指出，肺动脉重构与PHS的关系［10］，而李英等学者则进一步阐述了5－HT及SERT在PHS发生中的作用［2－3］。成纤维细胞作为血管外膜的重要细胞成分，能分化成肌成纤维细胞，合成胶原蛋白等细胞外基质，并向管腔内膜迁移，参与新生内膜的形成，从而参与到血管重构的过程中。

无论是5－HT，抑或是成纤维细胞的增殖和结缔组织的沉积，在PHS肉鸡肺血管重构时均起到作用。我们有理由相信两者之间存在一定的联系。学界关于两者相互关系的研究相对较少，本文从体内试验的角度，为5－HT影响肺成纤维细胞增殖和合成细胞外基质寻求间接理论依据。

根据我们的试验结果，静脉注射纤维素颗粒能显著的提高肉鸡PHS的发病率，这与我们以往的报道一致［7］。与此同时，通过对肺组织胶原蛋白含量变化以及5－羟色胺含量的观察，我们留意到发病肉鸡肺组织5－HT含量与胶原蛋白含量同步升高，表明PHS肉鸡发生了肺组织胶原蛋白沉积的现象，结合肺组织显微形态学观察出现的典型肺血管重构现象（另文发表），可以推断本试验中PHS肉鸡出现的肺血管重构与肺组织胶原蛋白沉积有关，而5－HT含量增高可能是肺组织胶原蛋白沉积的直接原因。灌喂SERT抑制剂的组别，无论是PHS的发病率，抑或是肺组织5－HT的含量和胶原蛋白含量均与正常对照组差异不显著，我们以此推测，抑制SERT，即抑制5－HT活性，能够降低肺成纤维细胞合成胶原蛋白的能力，从而减轻肺血管重构，抑制PHS的发生。5－HT是否能直接影响肺成纤维细胞的增殖与合成，有待进一步通过体外培养试验证实。

［1］Peacock，A.J.，C.Picket，etal.The relationship between rapid growth and pulmonary hemodynamics in the fast－growing broiler chicken［J］.Am Rev Respir Dis，1989，139：1524－1530.

［2］李英，曾健滢，韩前彪，等.肺动脉高压肉鸡肺小动脉中膜5－HT量及其与肺血管重构的关系［J］.畜牧兽医学报，2011，42（8）：1155－1160.

［3］李英，曾健滢，韩前彪，等.5－羟色胺对肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响［J］.中国兽医学报，2011，31（8）：1205－1207.

［4］李英.5－羟色胺及5－羟色胺转载体在肉鸡肺动脉高压综合征发生中的作用［D］.广州：华南农业大学，2009.

［5］刘健华，梁礼成，金久善.肺血管结构重建与肉鸡肺动脉高压形成的关系［J］.畜牧兽医学报，2003，34（5）：515－520.

［6］Siow R C，Mallawaarachchi C M，Weissberg P L.Migrationg of adventitial myofibroblasts following vascular balloon injury：insights from in vivo gene transfer to rat carotid arteries［J］.Cardiovasc Res，2003，59（1）：212－221.

［7］李英，曾健滢，潘家强，等.静脉注射纤维素微粒诱发肉鸡腹水综合征模型的建立［J］，中国兽医学报，2011，31（2）：245－248.

［8］徐铮，白云，修贺明.胃酶酸解法测定肝组织羟脯氨酸含量［J］.华北国防医药，2010，22（3）：235－236.

［9］孙程程，迟雁，王化虹，等.内脏高敏感大鼠结肠5－羟色胺转运体蛋白的表达［J］.世界华人消化杂志，2010，18（14）：1428－1433.

［10］潘家强.早期限饲、肉鸡肺小动脉重构和肺动脉高压综合征关系的研究［D］.南京：南京农业大学，2005.