牛分枝杆菌特异性多重PCR反应在临床样本检测中的应用

王春芳，于 丹，王 建，钱爱东

（1.吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春130118；2.长春市动物疫病预防控制中心，吉林 长春130000）

牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的慢性肉芽肿性疾病，主要感染动物的淋巴结和肺脏。在基因组水平上，牛分枝杆菌和结核分枝杆菌同源性达到99.95%［1］。不同生态型的牛分枝杆菌都具有非常广的感染范围。獾、鹿、哺乳动物以及一些自由生活的物种都能感染牛分枝杆菌。牛和牛之间的传播可能是最重要的传染途径［2］。

牛结核病的传统诊断方法主要是应用结核菌素（PPD）皮试，该方法成本低、应用简单，但缺乏灵敏度和特异性。对牛分枝杆菌的培养具有低灵敏度、耗时、费力等缺点。因此，建立快速、可靠地检测牛分枝杆菌的方法对于控制牛结核病就显得尤为重要。聚合酶链反应（PCR）具有灵敏、特异、快速等特点，已被用于牛结核病的流行病学调查［3－6］。

研究证实，在牛分枝杆菌recA基因中，存在两个内蛋白插入位点：recA－a和recA－b。在recA－a位点，存在一个1 320bp的内蛋白，该内蛋白只存在于牛分枝杆菌和结核分枝杆菌中，在其他分枝杆菌中并不存在此内蛋白，因此该序列可被用于PCR诊断的靶序列［7－10］。IS6110和IS1081均是结核分枝杆菌复合体（MTBC）中共有的插入序列。IS6110是一功能性转座子，在牛分枝杆菌中存在1～5个拷贝［11－12］。IS1081在 MTBC中存在6个拷贝［13］。因此，本研究应用已建立的三重PCR反应IS6110－IS1081－recA［14］检测牛全血中的牛分枝杆菌，为研究新型诊断试剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂EXTaqDNA聚合酶、核酸分子量标准DL－2 000、dNTPs和pMD18－T载体，均购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收纯化试剂盒，购自杭州维特洁生化技术有限公司；全血基因组DNA提取试剂盒，购自北京索莱宝生物技术有限公司。

1.2 样本 自某屠宰场采集256份血液样本，每份血液样本采集两份，其中1份离心分离血清用于间接ELISA检测，应用建立的三重PCR反应检测另外1份血液样本。

1.3 牛全血基因组DNA提取及特异性基因的PCR扩增 应用北京索莱宝生物技术有限公司的全血基因组DNA提取试剂盒提取牛全血基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，应用已构建的三重PCR反应进行PCR扩增［14］。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.4 recA、IS6110和IS1081基因PCR产物的纯化及序列分析 在T4DNA Ligase的作用下，纯化的PCR产物与pMD18－T载体进行连接，构建重组质粒pMD18－T－6110，pMD18－T－1081，pMD18－T－recA。阳性重组子由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，应用BLAST进行序列分析。

2 结果

2.1 牛全血样本PCR检测结果 应用间接ELISA和多重PCR反应检测采集的256份血液样本。结果发现，其中2份（25号和32号）血液样本ELISA检测结果和PCR检测结果均呈阳性（见图1）。

2.2 牛分枝杆菌特异性基因的序列分析 在T4 DNA Ligase的作用下，纯化的PCR产物与pMD18－T载体进行连接，构建重组质粒pMD18－T－6110，pMD18－T－1081，pMD18－T－recA。每 个 阳 性重组子分别取4个菌落进行序列分析。结果发现，牛分枝杆菌特异性基因IS6110，IS1081和recA与M.bovisAF2122／97株的同源性均达到99%以上，结果见表1所示。

图1 牛全血多重PCR检测电泳图谱

表1 牛分枝杆菌特异性基因的同源性比较

3 讨论

牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种人兽共患慢性传染病。近年来，由于有效诊断方法的缺失使牛结核病严重流行，因此建立快速可靠的检测方法就成为研究热点。聚合酶链式反应具有灵敏、特异等特点，可用于牛分枝杆菌检测。2007年，Taylor等［15］建立了IS1081特异性PCR反应，对淋巴结有明显病灶的牛进行检测，结果检测的敏感性可达 到 2.35fg DNA。Ben 等［16］应用建立的IS6110PCR反应检测339份肺组织样本，敏感性和特异性分别达到93.8%和98.6%。与牛分枝杆菌培养和鉴定的漫长过程相比较，PCR方法仅需1～2 d即可明确诊断，具有很大的潜在临床应用价值。本试验建立的recA－IS6110－IS1081三重PCR反应，可做为M.bovis和结核分枝杆菌快速检测和流行病学调查工具，应用该方法诊断结核病将具有非常重大的意义。

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