运输应激对大鼠空肠形态与热休克蛋白家族mRNA表达的影响

舒班超，麻武仁，尹 朋，刘凤华，侯晓林，钟友刚，余 进，徐霄龙，万长荣，宋晓平，许剑琴

（1.西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌712100；2.中国农业大学动物医学院，北京 海淀100193；3.北京农学院动物科技学院，北京 昌平102206）

运输应激广泛发生在动物的运输过程中，运输途中的各种刺激因子，对动物造成的心理和生理上的影响统称为运输应激。运输应激对动物是一种强烈的刺激，动物经过运输应激后易产生生长停滞、免疫抑制和组织损伤，严重时甚至导致动物死亡。由于运输应激是多种应激原对机体的综合作用，给运输应激反应机理研究带来较大困难。动物对于运输途中的摇晃、高温／低温、震动、碰撞、噪音、饥渴、拥挤等刺激易产生应激反应［1］。本试验利用摇床模拟了对运输应激中较为重要的6个应激因子：摇晃、高温、碰撞、噪音、饥渴、拥挤，并将摇晃与温度刺激分别固定在60r／min与35℃，以使其得到重复性较好的大鼠运输应激模型。运输应激会造成动物重要器官如心脏、肝脏、肾脏等一定程度的损伤［2］，而关于小肠与运输应激的关系尚未有人报道。小肠是机体消化吸收的重要器官，又被称为应激反应的启动器官，在应激反应中小肠黏膜最先遭受损伤，并导致肠道黏膜免疫屏障遭受破坏，肠道致病微生物的入侵会进一步加剧应激反应，并最终导致应激综合征。

Hsps称为热休克蛋白家族，主要分为：Hsp90家族、Hsp70家族、Hsp60家族及小分子量Hsp27家族［3］，Hsp27是Hsp27亚家族中的重要一员，主要参与微丝的稳定和细胞因子信号转导等，保护细胞免受各种应激因素的损伤［4］，Hsp70家族在几乎所有生物的应激细胞中都经常高度地被诱导，广泛参与各种保护机体和细胞的功能，在运输应激部分器官中也会高度表达。Hsp90作为特异分子伴侣调节蛋白的生物活性，防止蛋白质的变性和聚集。它们对维护细胞生存和内环境的稳定有重要意义。然而动物运输应激后Hsps在空肠中的表达情况，以及其与空肠损伤的关系尚罕见报道。

1 材料与方法

1.1 试验动物 成年雄性SD大鼠20只（北京维通利华实验动物技术有限公司提供），体重为270±20g。

1.2 主要仪器和试剂 仪器 DHZ－CA型水平摇床（江苏太仓仪器厂，中国）；Leica RM 2126RT型切片机（上海铼卡仪器有限公司，上海）；Olympus BX51生物显微镜（Olympus，日本）；BIO－RAD My－Cycler PCR 仪（BIO－RAD， 美 国）；Stratagene Mx3005P荧光定量PCR系统（Stratagene，美国）。试剂：苏木精，依红，Trizol Reagent（Invitrogen，USA）；M－MLV 反转录酶（Promeage USA）；RNA酶抑制剂（Promega，USA）；Brilliant II Fast SYBR Green QPCR Master Mix（Agilent Technologies，USA）。

1.3 运输应激大鼠模型的建立 将20只270±20 g的SD大鼠适应性饲喂1周后，随机均分为4组：对照组、运输应激1d组、运输应激2d组、运输应激3d组。应激条件为35℃，60r／min，每天应激2h。应激后大鼠出现运输应激临床症状，以及血清皮质醇浓度升高，表明模型构建成功。

1.4 取材及材料处理 应激结束后，各组大鼠分别先进行体重与肛温测定；眼球静脉采血，分离血清进行皮质醇的测定；最后断头处死，暴露腹腔，分离肠道。将空肠组织分别放入4%中性甲醛溶液中固定或在液氮中冷冻保存。固定好的组织用于常规石蜡切片的制备，冻存的样品则用于RNA提取与荧光定量PCR。

1.5 体重与肛温测定 应激前后分别利用电子天平对大鼠进行体重测量，用电子温度计插入肛门5cm处进行肛温测量。

1.6 血液生化指标 血清中皮质醇（Cortisol）测定则采用放射免疫方法。

1.7 空肠病理组织学观察 剖腹，取距Treitz韧带下10cm的近端空肠3cm，进行组织病理学检查。病理学检查标本用4%甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，组织块包埋时力求方向垂直。标本经常规石蜡包埋后，做肠管横切面的连续切片，切片厚度为5μm。切片后H.E.染色，镜检。

1.8 RNA提取与cDNA合成 取冻存空肠标本50mg，使用Trizol法提取总RNA。核酸蛋白仪检测RNA浓度与纯度，只有260／280比值介于1.9～2.1的RNA用于反转录。使用2μg总RNA进行反转录，反转录采用两步法完成，cDNA产物－20℃保存。

1.9 荧光定量RT－PCR测定大鼠空肠中 Hsps mRNA的转录 根据GenBank上大鼠Hsp27、Hsp70和Hsp90的基因序列，利用Primer Premier 5.0引物设计软件分别设计相应的引物，引物序列见表1。采用SYBR GREEN法对运输应激前后大鼠空肠组织Hsps表达量进行荧光定量PCR分析。PCR反应体系如下：cDNA模板1μL、PCR Mix 10 μL、ROX 0.3μL，上下游引物各1μL，用灭菌蒸馏水加至20μL。扩增条件为95℃10min；95℃10 s，60℃30s，40个循环，每个循环结束时，收集荧光值；循环结束检测融解曲线。大鼠Hsps mRNA的定量结果均用β－actin mRNA 的含量作归一化 处理。

表1 Hsps引物序列

1.10 数据处理 试验数据均以“平均数±标准误”（X±SEM）表示，采用SPASS11.5统计软件进行方差分析，对各组数据进行One－Way ANOVA比较，P＜0.05记为差异显著。

2 结果与分析

2.1 运输应激对大鼠行为的影响 大鼠在运输应激过程初期先表现为好动，适应后逐渐安静。随着应激时间延长，大鼠开始表现出焦虑，逃逸行为，并且开始吐沫，最后阶段表现为精神委靡。若应激时间长于3h则大鼠发生死亡。

2.2 运输应激对大鼠体温与体重的影响 运输应激1d和3d后，大鼠肛温对比应激前显著上升（图1A）。表明运输过程中大鼠代谢速率加快，导致机体产热增加。运输应激1d和3d后，大鼠体重显著降低（图1B）。说明，在运输应激过程中，大鼠消耗了大量的体能，致使机体体重降低。2.3 运输应激对大鼠血液皮质醇的影响 大鼠分别应激1d和3d后，相对于对照组血清中皮质醇浓度均显著升高，应激2d后皮质醇浓度相对于对照组升高但不显著（图2），说明大鼠已处于应激状态。大鼠运输过程中的行为变化，体温升高、体重降低，以及皮质醇浓度的升高，表明运输应激模型构建成功。

2.4 运输应激对大鼠空肠形态H.E.染色观察H.E.染色后光镜下观察可见，对照组大鼠空肠肠结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，排列规则。柱状上皮细胞，呈高柱状单层排列，胞浆丰富，胞核椭圆形，位于细胞基部。杯状细胞散在于柱状上皮细胞之间，呈高脚杯状（图3A）。而运输应激后1，2，3d，大鼠空肠黏膜均受不同程度损伤，绒毛顶部上皮细胞部分脱落现象（图3），从小肠的前段到后段，损伤程度逐渐减轻。第1天运输应激大鼠空肠结构变化，主要表现为绒毛顶端上皮细胞部分脱落（图3B），应激第2天则表现为绒毛顶端上皮细胞成片剥离（图3C），而应激第3天绒毛大面积剥离，且绒毛长度变短（图3D）。杯状细胞的数量也随着应激时间的增加而增加。

图3 分别运输应激1，2，3d后大鼠空肠H.E.染色图片（200×）

2.5 空肠Hsps mRNA表达量变化 我们选取了具有代表性的运输应激1d和3d的大鼠，分别代表单次应激和多次应激进行基因表达水平研究。对于应激2d的大鼠没有继续进行试验。由图4可见，分别经2h运输应激1d和3d后，Hsp27、Hsp70、Hsp90mRNA表达量与对照组相比均显著升高。其中Hsp27在应激第1天升高8.6倍，在第3天则升高了10.5倍（图4A）。Hsp70升高最为显著，在第1天应激结束后表达量上升了45.5倍，而第3天应激结束时继续升高至54倍（图4B）。Hsp90第1天升高了3.6倍，应激3d升高了3.3倍（图4C）。

3 讨论

运输应激是动物对运输途中多种应激原刺激所做出的反应。实际运输过程中由于应激原条件变化较大，给科学评价机体对运输应激反应带来较大困难。因此选取合适的仪器进行模拟，并对应激条件进行固定，有一致［1，5］，表明利用摇床在60r／min，35℃，2h的条件下可以很好的模拟公路运输应激。

先前研究表明，运输应激可以引起心脏、肝脏、肾脏发生损伤，本试验中我们发现运输应激也会引起空肠的明显损伤。伴随着应激时间的增加，大鼠空肠结构发生病理变化，损伤逐渐加重。空肠绒毛从顶端上皮细胞部分脱落，变为绒毛上皮细胞成片剥离，最后呈现为绒毛上皮细胞大面积剥离，且绒毛长度变短。应激时机体内热休克蛋白的表达量会发生急剧变化，以保护组织细胞免受伤害。细胞内Hsp尤其是Hsp27和Hsp70可抑制应激激活蛋白激酶，抵制细胞凋亡信号转导中的蛋白水解酶和氧自由基生成，并抑制p53介导的细胞凋亡，从而可在热应激、氧化应激、电离射线等引起的细胞凋亡中起保护作用［6］。据李玉保等人报道，猪经1、2、4、6h和10h的运输应激后，在猪肾脏［7］、肝脏和心脏［8］组织中Hsp70mRNA的转录水平随着应激时间的延长一直呈现上升的趋势［9］。同样在Hsp90的研究上，李玉保、鲍恩东等人报道，Hsp90mRNA表达量在肝脏和心脏［8］中上升。在我们的试验中，我们得到了相似的结果，大鼠空肠中 Hsp27，Hsp70，Hsp90mRNA的表达量在运输应激后均显著上升。相比应激第1天，应激第3天Hsp27与Hsp70mRNA表达量持续升高，而Hsp90mRNA的表达量则在第3天较第1天有所下降。

本试验中随着大鼠运输应激时间增加，空肠病理变化逐渐加重，同时Hsp27，Hsp70，Hsp90的表达量也大幅升高。表明大鼠空肠组织损伤与Hsps表达量之间有着直接的联系。运输应激中Hsp27，Hsp70可能参与了对抗运输应激所引起的损伤与凋亡。Hsp90则可能主要在运输应激中参与修复应激中损伤的蛋白分子。作为一类保护性分子，Hsps在大鼠运输应激后空肠组织内表达量急剧升高，可以起到保护空肠组织细胞，抵抗应激性损伤的作用。运输应激后表达量急剧升高的Hsps，可能是动物抵抗运输应激的重要机制之一。

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