猪流行性腹泻病毒感染的诊断与病毒的初步分离

蒋 梅，杨泽晓，张荣昌，姚学萍，王 印

（1.四川农业大学动物医学院，四川 雅安625014；2.西藏昌都地区动物卫生及植物检疫监督所，西藏 昌都854000）

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起哺乳仔猪腹泻、呕吐、脱水和高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。自1971年首次在英国和比利时报道之后，日本、韩国、加拿大、中国等世界各国相继报道了PED的发生［1－2］。该病对全世界的养猪业造成了严重的经济损失。PEDV属于套式病毒（Nidovirales）冠状病毒科（Coronauiridae）冠状病毒属（Coronauirus），基因组核酸为单股正链RNA，有侵染性，长约28kb［3］。病毒颗粒呈球状，有囊膜和纤突，核衣壳呈螺旋状对称［4］。1988年瑞士的首次报道PED病毒在Vero细胞上培养获得成功之后，我国的学者也先后在PK－15、Vero、ST等细胞上进行了该病毒分离的报道。

日前，四川省某猪场发生大规模的仔猪腹泻性致死性的疾病，临床症状水样腹泻或伴随呕吐（多发于吃食或吮乳后）、脱水；粪稀如水，呈灰黄色或灰色。少数病猪体温升高1℃～2℃，精神沉郁，食欲减退或不食，尤其是繁殖种猪。该病猪年龄越小，临床症状越重。本试验采集发病猪场病死猪的肠系膜淋巴结提取总RNA和DNA进行了RT－PCR和PCR检测 ，并对引起该次大规模腹泻的病料进行了病毒的初步分离纯化，为进一步对该病的防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病料的采集 采集病死猪和发病猪的肠系膜淋巴结，以及脱落的肠黏膜用于进一步的（RT－）PCR检测和病毒分离。

1.2 主要试剂和引物 根据文献［5］选择的Vero细胞（由四川农业大学动物医学院生物技术中心提供）来进行病毒分离，DMEM（HyClone）营养液，0.25%胰蛋白酶－EDTA消化液，购自北京索莱宝科技有限公司；RNAiso Plus、RT－PCR反转录试剂盒，购自TaKaRa公司；Tap Mix，购自博迈德科技发展有限公司，DNA Marker，购自TIANGEN公司；DNA胶回收纯化试剂盒，购自北京天恩泽基因科技有限公司；琼脂糖，购自BIOWEST公司；伪狂犬病病毒（PEV）、圆环病毒（PCV2）、细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸障碍病毒（PRRSV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）的特异性引物分别根据参考文献［6～12］，由上海英骏生物技术有限公司合成；PEV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、JEV 等病毒的阳性血清，由本实验室自制并保存。

1.3 病毒RNA和DNA的提取及检测 取病死猪和发病猪的肠系膜淋巴结，根据RNAiso Plus提取总RNA，按照反转录试剂盒反转录为cDNA，DNA的提取参考文献［13］采用酚－氯仿法。

1.4 猪源其他病毒的（RT－）PCR扩增 以1.3步骤中所得到的cDNA和RNA作为模板，用PEV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、JEV、PEDV 特异性的引物进行（RT－）PCR扩增。

1.5 病毒分离 取病死猪肠系膜淋巴结和已脱落的肠黏膜剪碎，置于研钵中，滴加5～10倍体积的生理盐水，研磨20min，反复冻融3次后转入EP管中加入青霉素（1 000IU／mL）、链霉素（300μg／mL）37℃水浴1h，之后经4 000r／min离心30min，取上清用0.22μm的滤膜过滤之后用灭菌的EP管收集或直接取0.6mL接种在长成单层的Vero细胞，每隔6～10h观察细胞病变。

1.6 病毒纯化 在Vero细胞上盲传病毒至第25代之后在收集的病毒液里面加入PEV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、JEV等病毒的阳性血清，37℃温育1h后继续在Vore细胞上继续传代，收集病毒液，进行猪源其他病毒RT－PCR检测。

2 结果

2.1 病毒RNA和DNA的提取及检测 获取病料中核酸，经PCR或RT－PCR后琼脂糖电泳检测，PEV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、JEV 等病毒的核酸扩增均为阴性，PEDV出现预期大小的阳性条带664bp，结果见图1。PCR产物的序列测定结果显示同源性98%～99%，判定PEDV核酸阳性。

2.2 病毒的分离培养 用Vero细胞同步接毒后毒株在盲传前5代时细胞都没有发生明显的病变，传至第6代逐渐开始有病变，等传至25代以后细胞接毒24～32h出现了病变：细胞折光度降低、变圆、体积缩小、碎裂、细胞部分脱落见图2。

2.3 病毒的纯化 在第25代之后收集的病毒液里面加入PEV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、JEV 等病毒的阳性血清，37℃温育1h后继续在Vero细胞上传代培养，同时取传代细胞提取RNA和DNA做PCR或RT－PCR检测，结果显示，除PEDV扩增出约664bp目的条带外，其他病毒均为扩增阴性见图3。

图3 病毒纯化后做猪外源病毒检测结果

3 讨论

本试验从疑似PEDV的发病猪群的病死猪采集肠系膜淋巴结、脱落的肠黏膜等病变组织，采用RT－PCR进行实验室诊断，并进行了PCR产物的序列测定，结果显示，PEDV核酸阳性，同时我们对PEV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV等常见病毒也进行了检测均为核酸阴性，结合其流行病学、临床症状和抗生素治疗效果不佳等方面，判定引起该次仔猪腹泻大规模致死的病原为PEDV。同时本研究采用Vero细胞对其病毒进行了初步分离，并经过RTPCR检测与PEDV扩增目的DNA片段大小相符，为进行一步PEDV防治的相关研究提供科学材料和参考依据。

对于 PEV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、JEV、PEDV等猪外源性病毒来说，均可以采用猴肾细胞来进行分离［14］，因此此次的病毒分离采用Vero细胞；病毒传至第6代开始出现病变，提示病毒已经适应了Vero细胞，可稳定的增殖，传代6次以后进行外源病毒的阳性血清中和试验应该比较合适，同时发现传至第25后代病毒在24h左右就已经发生明显的细胞病变，考虑到试验的可靠性，本研究收集第25代后细胞毒进行（RT－）PCR检测。为保证病毒的分离纯化工作的顺利进行，本试验采用猪源病毒（PEV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、JEV）阳性血清处理继续传代，一方面提高了病毒纯化效率，大大缩短了分离纯化病毒所需要的时间，另一方面排除PEV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、JEV 等病毒感染的可能。

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［10］GB／T 18090－2008，猪繁殖与呼吸综合征诊断方法［S］.

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［14］第十章 常见的致动物疾病性病毒［DB／OL］.http：／／www.doc88.com／p－28344541422.html.