加味温胆汤对抑郁模型大鼠海马NMDA-NR1mRNA／蛋白表达的影响1）

张 曼，张丽萍，武 丽，顾志敏

抑郁症是一种常见的心境障碍综合征，烦躁、紧张不安的精神状态，以及忧郁、悲伤的情感状态是其主要临床表现［1］。研究表明，孤养结合慢性不可预知性应激模型能较好模拟抑郁症精神及情感状态［2］，被认为是目前与人类抑郁状态最为吻合的模型，已广泛应用于抑郁症发病机制及抗抑郁药物的药理学研究［3，4］。

N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体阻断剂及其相关药物已被证实具有抗抑郁作用［5］。研究表明，应激使大鼠海马NMDA受体（NMDA-NR1）过度激活从而造成兴奋性神经毒性作用，导致神经元凋亡，从而引发抑郁症［6-8］。动物实验中通过终期效应观察证实，加味温胆汤具有较好的抗抑郁功效，其机制与调节海马神经元凋亡有关［9］。加味温胆汤的抗抑郁机制可能与抑制NMDA受体，阻抑神经元凋亡有关。本研究以孤养结合慢性应激抑郁模型为研究对象，在抑郁形成的不同阶段动态研究加味温胆汤对抑郁模型大鼠海马NMDA-NR1mRNA／蛋白表达的阻抑作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 8周龄SD雄性大鼠128只，动物合格证号：SCXK（湘）2009-0004，体质量180g±20g，清洁级，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。按照随机数字表分组法，将大鼠随机分成空白组、模型组、中药组、西药组，每组32只。中药组予加味温胆汤12g／（kg·d）灌胃，西药组予氟西汀1.8mg／（kg·d）灌胃，模型组、空白组予生理盐水2mL／（kg·d）灌胃，每日08：00开始，持续28d。各组在实验1d即开始行相应干预方法处理。

1.2 实验材料 RNA prep pure动物组织RNA提取试剂盒（离心柱型），天根生化科技（北京）有限公司；Prime Script TMRT Reangent Kit（Perfect Real Time）TaKaRa；SYBR RPremix Ex TaqTM（Perfect Real Time）TaKaRa；Western及IP细胞裂解液，碧云天公司；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；一抗兔抗人NMDA-NR1蛋白多克隆抗体，Saierbio公司；二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG，中杉金桥生物有限公司；转印用PVDF膜，美国Bio-rad公司。

1.3 孤养结合慢性应激抑郁模型［10］大鼠均单笼饲养，采用24h禁食，通宵照明，4℃冷水游泳5min，45℃烘箱热烘5 min，夹尾1min，高速水平振荡3min，100伏电击足底1min，悬尾1min，共9种刺激方法，随机安排到21d内，每日一种，每种刺激至少出现2次，同种刺激不能连续出现，使动物不能预料刺激的发生。

1.4 检测指标与方法 在实验7d，14d，21d，28d从每组中随机选择8只大鼠，行旷场行为检测，然后断头取脑，分别进行QRT-PCR检测机Western Blot检测。

1.4.1 旷场行为（open-field） 以动物穿越旷场试验箱底面方块数为水平活动得分（四爪均进入方格方可计分）；以直立次数为垂直活动得分（两前爪腾空或攀附墙壁方可计分）。分别在7d，14d，21d，28d测定，每次3min。

1.4.2 QRT-PCR检测 设计合成扩增的cDNA的引物。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列分别为：CREB1-f：5’-GCC TCT GGT GAT GTA CAA ACA TAC C-3’；CREB1-r：5’-GGG AGG ACG CCA TAA CAA CTC-3’，引物片段长度82bp；为准确检测表达水平，同时选用内参引物：beta-actin-f：5’-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3’；beta-actin-r：5’-CGA TAG TGA TGA CCT GAC CGT-3’，引物片段长度为137bp。

提取海马组织总RNA，采用紫外分光光度计检测OD26O／OD280比值。

进行逆转录反应。将提取的总RNA反转录为cDNA。

1.4.3 Western-Blot检测 按照试剂盒要求提取海马组织，根据样品OD值调整蛋白浓度。NMDA-NR1蛋白相对表达量以相应蛋白／beta-actin灰度值表示。

1.5 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件处理，数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 结 果

2.1 统计学描述 在实验24d时，中药组1只大鼠因灌胃损伤死亡，此鼠数据不纳入统计。共127只大鼠进入结果分析。

2.2 open-field检测 在抑郁形成过程中，模型组open-field实验水平、垂直运动得分均呈上升趋势，21d、28d时，两组比较有统计学意义（P＜0.01）；经治疗后，抑郁大鼠水平运动及垂直运动得分得到上调，21d、28d时中、西药组水平运动及垂直运动得分高于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。详见表1、表2。

表1 各组大鼠在抑郁形成不同时间段水平运动得分比较（x±s） 分

表2 各组大鼠在抑郁形成不同时间段垂直运动得分比较（x±s） 分

2.3 海马NMDA-NR1mRNA表达检测 21d时与空白组比较，模型组大鼠海马NMDA-NR1mRNA表达增加（P＜0.01）；与模型组比较，中、西药组NMDA-NR1mRNA表达减少（P＜0.05）。28d时与空白组比较，模型组NMDA-NR1 mRNA表达增加（P＜0.01）；与模型组比较，中、西药组NMDANR1mRNA减少（P＜0.05）。详见表3。

表3 不同时间段各组大鼠NMDA-NR1mRNA相对表达量（x±s） %

2.4 海马NMDA-NR1蛋白表达检测 21d时与空白组比较，模型组NMDA-NR1蛋白表达增加（P＜0.01）；与模型组比较，中、西药组NMDA-NR1蛋白表达减少（P＜0.05）。28d时与空白组比较，模型组NMDA-NR1蛋白表达增加（P＜0.01）；与模型组比较，中、西药组NMDA-NR1蛋白减少（P＜0.01）。详表4。

表4 各组大鼠在抑郁不同时间段NMDA-NR1蛋白相对表达量比较（x±s） %

3 讨 论

旷场实验中的水平运动得分反映动物活动度情况，垂直运动评分反映动物对新鲜环境的好奇程度，抑郁模型大鼠旷场实验的水平运动评分及垂直运动评分均低于正常大鼠［11］。本实验观察到，抑郁模型大鼠在实验21d、28d出现以上相似变化，加味温胆汤对此变化具有拮抗作用，21d，28d时具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。由此推断，加味温胆汤对抑郁模型大鼠具有较好抗抑郁效应，21d时显效，随着干预时间的延长，28d时效应进一步增强。

在抑郁症发病机制及抗抑郁治疗中，NMDA受体的作用已受到关注。目前已知，NMDA受体广泛存在于中枢、海马、纹状体等部位，具有调节Ca2＋门控通道，引起细胞毒性作用。在应激刺激时，谷氨酸（Glu）所产生的迟发性损伤主要由NMDA受体介导，Glu不断增加，过度激活的NMDA受体，使配体门控性Ca2＋通道病理性开放，引起大量胞外Ca2＋内流，导致细胞内Ca2＋超载。胞外钙大量内流引起细胞内钙超载是细胞死亡的重要原因，是多种因素引起神经细胞功能和结构损害直至死亡的“最后共同通路”。胞浆内游离钙浓度升高的直接后果是激活在正常条件下受钙调控的各种酶系统，包括蛋白酶、氧化酶系、蛋白激酶、磷脂酶、核酸内切酶等，其结果不但进一步加重生物膜的损害及能量危机，而且与自由基的产生及其损伤作用密切相关。越来越多的临床研究证实，NMDA-NR1在抑郁症的病理生理机制及抗抑郁药治疗中起着重要作用，临床中发现抑郁症患者脑中NMDA-NR1表达升高［12］。在抑郁动物模型中，NMDA-NR1拮抗剂已被证实具有抗抑郁作用［13，14］。

本实验发现，模型组NMDA-NR1mRNA及蛋白表达在抑郁形成过程中呈上升趋势，21d时模型组NMDA-NR1mRNA及蛋白表达高于空白组（P＜0.01），28d时差异增大（P＜0.01）。由于在生物体内NMDA-NR1兴奋性由其数量及活性所决定，从而提示抑郁模型大鼠海马NMDA-NR1处于兴奋状态。研究同时发现，加味温胆汤的抗抑郁效应随着干预时间的延长，至28d时明显增强。加味温胆汤可能通过阻抑NMDA-NR1兴奋性发挥其抗抑郁效应。结合前期加味温胆汤对抑郁模型大鼠海马神经元凋亡阻抑作用的研究结果［9］，认为加味温胆汤抗抑郁效应的药理机制可能与阻抑海马NMDA-NR1兴奋性，减少神经元凋亡有关。

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