中西医结合心脑血管病杂志社大鼠脑梗死后神经前体细胞移行及电针作用的研究

王少帅，李常新，尤洪岭，王艳艳

神经前体细胞（neural precursor cells，NPCs）具有自我更新和增殖为神经元和胶质细胞的能力。脑梗死后NPCs可移行至缺血灶周围，补充、修复神经元的缺失和功能损伤，发挥内源性抗损伤修复作用[1]。本研究旨在动态观察急性脑梗死及电针治疗后梗死灶边缘Brdu阳性细胞数和DCX阳性细胞数，探讨脑梗死后电针治疗对NPCs移行在中枢神经损伤修复中的作用。为卒中后神经功能恢复提供一种新思路。

1 材料与方法

1.1 动物来源及模型制备 选用2月～3月龄雄性SD大鼠（山西医科大学实验动物中心提供）60只，体重80g～120g，应用双肾双夹法复制易卒中型肾性高血压大鼠（RHRSP）模型。用大鼠心率血压计经尾部测血压，肾动脉狭窄前测量1次，狭窄后每周1次。造模后16周取血压≥180mmHg且无脑卒中症状，体重450g～500g的RHRSP大鼠，参照 Wahl等[2]的方法电凝MCA跨嗅束后的主干，并于显微镜下见MCA供血中断，制成凝闭大脑中动脉（MCAO）模型。

1.2 神经功能评分 依照Garcia等[3]的18分综合评分法。MCAO后12h始每日（1周后改为2次／周）由2人同时评分，其中1人不知观察鼠属于何组。

1.3 动物分组 采取随机分组。对照组：RHRSP非MCAO（只作相同的开颅术，但不凝闭大脑中动脉）1周、2周、3周、4周，每周组3只，共12只；脑梗死组：RHRSP与 MCAO模型成功1周、2周、3周、4周，每周组6只，共24只；电针组：RHRSP与MCAO模型成功行电针治疗1周、2周、3周、4周，每周组6只，共24只。

1.4 方法

1.4.1 Brdu标记 使用细胞增殖特异性标记物Brdu，以10 mg／mL溶于生理盐水。各组于MCAO后24h始腹腔注射Brdu（50mg／kg）标记处于增殖状态的NPCs。在注射日共注射3次，间隔8h。分组及在MCAO后注射时间为：1周组第6天；2周组第6、13天；3周组第6、13、20天；4周组第6、13、20、27天，各组最后一次注射后12h处死取脑。

1.4.2 电针治疗 选穴穴位参考《实验针灸学》[4]中常用实验动物的针灸穴位而确定，针刺方法参考孟竞壁等[5]操作方法，MCAO后24h，用30号1寸毫针刺入病灶对侧，相当于人的手三里、外关、伏兔及足三里，进针深度2mm～3mm。针柄接至CMNS6－1型电子针灸治疗仪行电刺激，1次／日。频率2Hz连续波，输出强度3，20min／次。6d一疗程，停一天进行下一疗程。脑梗死组只做相同捆绑而不针刺。

1.4.3 病理学检查 经常规灌注后取脑，固定，脱水，石蜡包埋，由前向后作冠状切片，片厚5μm，取经梗死灶周脑组织。行常规HE染色，观察梗死灶周组织病变情况。梗死灶的计算：HE染色切片用Leica Q570图像分析检测。计算每张冠状切片上梗死灶的面积，每个组织块梗死灶体积按下列公式计算：V＝t1（A 1＋A 2）／2＋t 2（A 2＋A 3）／2＋…＋t n－1（An－1＋A n）／2（注：V为体积，t为两相邻冠状面的间距，A为每一冠状面上梗死灶面积，n为冠状面序列号）。

1.4.4 免疫荧光染色 分别检测各组不同时间点梗死灶周相同部位Brdu阳性细胞及DCX阳性细胞数。操作严格按照试剂盒说明进行，烤片，脱蜡，抗原修复，血清封闭，滴加荧光标记二抗，每张切片在灶周相同部位随机观察3个视野，400倍荧光显微镜下计数Brdu阳性细胞及DCX阳性细胞数。

2 结 果

2.1 模型制作结果 RHRSP术前血压为110.08mmHg±11.91 mmHg，术后16周平均血压为198.37mmHg±21.45mmHg。

2.2 神经功能评分 对照组评分18分（正常）。MCAO后评分随时间逐渐增高，5d时恢复正常，电针后2d与3d大鼠行为学评分较梗死组高（与脑梗死组比较，经t检验，P＜0.05）。

2.3 不同时间点各组脑组织病理变化情况 HE染色可见对照组神经元分布均匀，间隙正常，细胞核圆形蓝染。MCAO后1周梗死灶内脑组织软化，细胞肿胀、胞浆液化，细胞及小血管周围的间隙加宽。2周时上述区域为软化灶，灶内有炎性细胞浸润。3周、4周后病灶萎缩、深陷，灶内、灶周有疤痕形成，梗死后4周内随着时间延长梗死体积渐缩小。电针治疗后前3周梗死体积较脑梗死组缩小（P＜0.05），4周时无显著差别。脑梗死灶大小比较见表1。

表1 大鼠脑内各时间点不同处理组脑梗死灶大小比较（±s） %

表1 大鼠脑内各时间点不同处理组脑梗死灶大小比较（±s） %

组别 1周 2周 3周 4周脑梗死组 19.26±5.81 16.32±4.39 14.33±3.51 10.62±4.21电针组 16.35±5.441） 13.61±3.201） 12.54±4.121） 9.81±3.11与梗死组比较，经t检验，1）P＜0.05

2.4 不同处理组Brdu阳性和DCX阳性细胞数目 对照组Brdu阳性细胞数目很少，排列稀疏。脑梗死及电针治疗后梗死灶边缘Brdu阳性细胞数目较对照组均增多（P＜0.05），且电针组多于脑梗死组（P＜0.05），随时间逐渐减少。脑梗死后脑内DCX阳性细胞数目增加，缺血1周时细胞数增加达高峰，之后逐渐减低；电针治疗1周末细胞数目明显增加，2周～4周随时间延长数目较脑梗死组明显减少。DCX阳性细胞突起长，有时连在一起似链状；有的细胞突起对称向各不同方向伸展。各组Brdu阳性和DCX阳性细胞数目详情见表2。

表2 大鼠脑内不同处理组Brdu阳性和DCX阳性细胞计数（±s） 个／400倍视野

表2 大鼠脑内不同处理组Brdu阳性和DCX阳性细胞计数（±s） 个／400倍视野

组别 1周Brdu＋ DCX＋2周Brdu＋ DCX＋3周Brdu＋ DCX＋4周Brdu＋ DCX＋对照组 1.20±0.65 10.04±3.25 3.05±1.47 7.44±1.95 1.65±1.02 9.19±3.03 2.29±1.25 7.68±2.08脑梗死组 57.50±11.041） 54.01±12.661） 83.80±10.811） 45.91±9.781） 53.45±9.29 34.92±7.551） 31.08±8.201） 24.38±5.501）电针组 78.61±13.881）2）62.22±16.731）2）97.15±15.911）2） 40.18±10.371）2） 69.69±12.011）2）29.50±6.491）2）32.36±9.191）16.91±4.671）2）与对照组比较，经t检验，1）P＜0.05；与梗死组比较，经t检验，2）P＜0.05

3 讨 论

在正常成年哺乳动物脑内，NPCs主要存在于脑室区和脑室下区（SVZ）、连接侧脑室和嗅球的区域以及海马齿状回。生理状态下，NPCs有固定的迁移途径，经吻侧迁移流（RMS）迁移到嗅球分化成颗粒及球旁神经元。脑梗死后NPCs自SVZ呈链状穿过胼胝体、纹状体边缘到达缺血区，发挥它们修复损伤的作用[6]。

Brdu为细胞增殖的标记物，在中枢神经系统可作为增殖的NPCs的标记物。Doublecortin（DCX）是神经细胞的重要微管相关蛋白，在移行的神经元祖细胞有很强的表达，可作为移行细胞标志物。Zhang等[7]在MCAO后7d处死大鼠，发现缺血灶周出现大量DCX阳性细胞。在脑缺血后，脑损伤后的微环境使NPCs发生迁移。应用时间延迟拍摄显微镜发现DCX阳性细胞由SVZ多个方向移行至缺血灶周围，DCX可能作为一种内在蛋白来调节NPCs移行至缺血灶周围。本研究也证实，MCAO后灶周DCX阳性细胞数目明显增加，在1周末最多，之后逐渐减低。说明缺血可作为内源性因素诱导新生NPCs增殖并向梗死灶周围移行，而缺血急性期为移行高峰期。Li等[8]观察大鼠脑梗死后14d和30d行外周胡须刺激，发现DCX阳性细胞由SVZ移行至缺血灶周，外周刺激组细胞数明显多于梗死组；外周刺激组梗死灶周围Brdu＋／NeuN＋细胞数明显多于梗死组，提示外周刺激能够促进神经细胞移行，同时也发现外周刺激显著增加血管内皮生长因子（VEGF）和基质衍生因子－1（SDF－1）在缺血灶周的表达。最近大量研究表明[9，10]，VEGF 和SDF－1在NPCs移行过程中发挥重要作用。

电针有改善神经功能缺损、保护脑缺血后神经元等作用。本实验结果显示，电针治疗后3周内，梗死灶体积较脑梗死组明显减小，行为学评分明显低于脑梗死组，说明电针可减小脑梗死体积，促进神经功能恢复。MACO后各时间段电针组灶周Brdu阳性细胞数明显多于脑梗死组；DCX阳性细胞数1周末明显增加，2周～4周随时间延长数目较脑梗死组明显减少。证实电针能促进脑梗死后内源性NPCs增殖和向梗死灶周移行，且在梗死后一周效果最明显。提示电针可能在急性期通过改变脑内微环境，影响VEGF、SDF－1等细胞因子来促使NPCs向灶周移行，形成对病灶进行修复的物质基础。而随着电针治疗时间的延长，病灶逐渐恢复，推测可能影响移行的因子逐渐减少致使电针作用减弱。但电针与影响NPCs移行各因素的关系及具体作用机制，还有待于进一步的深入研究。

[1]Zhang RL，Zhang ZG，ZhangL，etal.Proliferation and differentiation of progenitor cells in the cortex and the subventricular zone in the adult rat after focal cerebral ischemia[J].Neuroscience，2001，105（1）：33.

[2]Wahl F，Allix M，Plotkine M，etal.Neurological and behavioral outcomes of focal cerebral ischemia in rats[J].Stroke，1992，23：267－272.

[3]Garcia JH，Wagner S，Liu KF，etal.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery oc－clusion in rats[J].Stroke，1995，26：627－635.

[4]邓春雷.实验针灸学[M].北京：人民卫生出版社，1998：7.

[5]孟竞壁，付卫星，宋利明，等.电针对实验性脑梗塞过程中脑氧代谢的影响[J].针刺研究，1986（3）：198－201.

[6]Luzzati F，De Marchis S，Parlato R，et al.New striatal neurons in a mouse model of progressive striatal degeneration are generated in both the subventricular zone and the striatal parenchyma[J].Plos One，2011，6（9）：e25088.

[7]Zhang RL，Chopp M，Gregg SR，et al.Patterns and dynamics of subventricular zone neuroblast migration in the ischemic striatum of the adult mouse[J].Cereb Blood Flow Metab，2009，29（7）：1240－1250.

[8]Li WL，Yu SP，Ogle ME，et al.Enhanced neurogenesis and cell mi－gration following focal ischemia and peripheral stimulation in mice[J].Neurobiol，2008，68（13）：1474－1486.

[9]Ohab JJ，Fleming S，Blesch A，et al.A neurovascular niche for neurogenesis after stroke[J].Neurosci，2006，26：13007－13016.

[10]Whitaker VR，Cui L，Miller S，et al.Whisker stimulation enhances angiogenesis in the barrel cortex following focal ischemia in mice[J].Cereb Blood Flow Metab，2007，27：57－68.