山茱萸水提取物对人肺癌A549细胞凋亡的作用

王恩军 靳 祎 季文琦 关 宏 肖 锋 (河北大学基础医学院，河北 保定 07000)

山茱萸水提取物对人肺癌A549细胞凋亡的作用

王恩军 靳 祎 季文琦1关 宏2肖 锋 (河北大学基础医学院，河北 保定 071000)

目的 探讨山茱萸水提取物对人肺癌A549细胞的体外增殖的抑制及凋亡作用。方法 采用MTT法及DNA琼脂糖凝胶电泳法检测山茱萸水提取物对A549细胞增殖的抑制及凋亡作用，并观察细胞形态改变。结果 山茱萸水提取物对A549细胞抑制作用较明显，在一定范围内呈现较好的量效、时效关系;经不同剂量的山茱萸水提取物处理的细胞电泳均出现相差约200 bp的DNA梯状电泳图谱，形态学观察到细胞凋亡。结论 山茱萸水提取物对人肺癌A549的细胞增殖有较强的抑制作用，能诱导其细胞凋亡。

山茱萸水提取物;肺癌;A549;抑制作用

山茱萸是山茱萸科落叶灌木或小乔木，其干燥成熟果实为中药，别名山萸肉、蜀酸枣、药枣、肉枣、薯枣、枣皮、鸡足、天木籽、实枣儿等，其味酸、涩、微温，归肝、肾经，有补益肝肾、涩精固脱之功效〔1，2〕，为我国常用的名贵中药材。现代医学证实山茱萸果肉中含有生理活性较强的山茱萸甙、酒石酸、没食子酸、苹果酸、树酯、糖类、鞣质和维生素等多种有效成分，具有免疫调节、降低血糖、抗血小板聚集、抗菌等多种药理作用。在抗癌研究方面，山茱萸对多种肿瘤细胞有明显的抑制作用〔3～5〕。本试验采用人肺癌A549细胞作为试验模型，研究山茱萸水提取物体外抗肺癌活性，探讨山茱萸的抗癌机制，为其临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

①山茱萸水提取物：由河北农业大学生命科学学院提供，每1 g相当于原生药2 g，制成500 mg/ml的溶液，高压灭菌4℃保存(原生药从河北安国县药材公司购买);②人肺癌A549细胞：购自北京军事医学科学院放射研究所，后经河北农业大学生命科学学院传代冻存提供。

1.2 试剂

RPMI 1640培养液、乙二胺四乙酸(EDTA)、胰蛋白酶(GIBCO公司);顺铂(齐鲁制药有限公司);四甲基耦氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司);琼脂糖(北京拜尔迪生物公司);200 bp DNA marker(华美生物工程有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 实验采用体外培养的A549细胞系，经0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA消化后吹打，1 500 r/min离心，稀释至细胞浓度1×105个/ml。接种在96孔培养板上，每孔200 μl。空白孔只加培养液不加细胞，每组设4个平行孔，置于 37℃、5%CO2的培养箱中培养 24 h〔6〕。

1.3.2 药物敏感性试验 待细胞贴壁后，实验组每孔加入不同剂量的山茱萸水提取物，分别为每孔 10，20，40，80 μl，使药物终浓度分别为25、50、100、200 mg/ml。放入培养箱分别培养24、48 h和72 h。以终浓度为20 μg/ml的顺铂作为阳性对照，以生理盐水作为阴性对照。

1.3.3 MTT法检测山茱萸水提取物体外抗肿瘤活性 待药物作用细胞规定时间后，取出培养板，每孔加入5 μg/μl的MTT液 20 μl，继续培养 4 h，吸掉培养液，每孔加入 DMSO 150 μl，震荡15 min，于酶标仪上在570 nm波长下测定各孔吸光度值(A值)，计算不同剂量的山茱萸水提取物对细胞增殖的抑制率(GIR)，所有试验重复3次。增殖细胞抑制率(%)=(1-实验组A值 /空白对照组A值)×100%。

1.3.4 形态学观察 取对数生长期的A549细胞接种于48孔细胞培养板内，培养24 h，实验组每孔加入20 μl的山茱萸水提取物，对照组加入生理盐水，培养48 h后在倒置显微镜下观察细胞的形态变化。

1.3.5 DNA琼脂糖凝胶电泳分析 取对数生长期细胞5瓶，每瓶共含有1×106个细胞，用细胞培养液把山茱萸水提取物稀释成不同浓度(终浓度为 0、25、50、100、200 mg/ml)，分别加入5个培养瓶中，加培养液至5 ml，培养48 h后，收集细胞，用PBS洗2次;加细胞裂解液，再加蛋白酶K，振摇使悬液混匀，50℃过夜;冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后离心，吸出上层水相，移至另一离心管中，重复抽提，直到无蛋白为止;吸上清加入氯仿/异戊醇(24∶1)再抽提一次，吸取水相层加入1/10体积的醋酸钠溶液混匀，再加入冷无水乙醇，离心，收集沉淀，70%乙醇漂洗2次，晾干;加入TE缓冲液融解DNA，再加入RNA酶，置37℃作用30 min，取10 μl提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4∶1混匀后点样，在2%琼脂糖凝胶上电泳2 h，电压为80 V，取凝胶到凝胶成像仪上拍照分析。

1.4 统计学方法 组间比较行t检验。

胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所);

2 结果

2.1 山茱萸水提取物对A549细胞抑制作用的量效关系

A549细胞经不同剂量的山茱萸水提取物处理48 h后，均显示较明显的细胞抑制作用，实验组与对照组比较，A值差异有统计学意义(P＜0.05)。其抑制率随浓度的降低有所下降，在一定范围内呈浓度依赖关系(量效关系)。见表1。

2.2 山茱萸水提取物对A549细胞抑制作用的时效关系

4种不同剂量的山茱萸水提取物作用于A549细胞24、48、72 h，随着作用时间的延长，抑制作用明显增强(时效关系)。见表2。

2.3 形态学观察

对照组肺癌A549细胞生长良好，密度较大，部分重叠成簇，为长梭形或多角形，排列无方向，细胞边缘清楚;A549细胞经山茱萸水提取物处理后，细胞体积缩小，数量减少，逐渐变为圆形，与周围的细胞分离，培养液中可见许多漂浮的颗粒。

2.4 DNA凋亡带的观察

A549细胞经不同浓度山茱萸水提取物处理48 h后，除空白对照外的细胞，电泳检测均可见DNA有规律的降解，形成了特征性的梯状条带(DNA ladder)，表明一定量的山茱萸水提取物可诱导A549细胞凋亡。

表1 不同剂量的山茱萸水提取物对A549细胞增殖的抑制作用(n=4s)

表1 不同剂量的山茱萸水提取物对A549细胞增殖的抑制作用(n=4s)

与对照组比较：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

组别 剂量 吸光值 抑制率(%)阴性对照组- 0.370±0.002 -阳性对照组 20 μg/ml 0.042±0.0042) 88.47±0.23山茱萸水提物 25 mg/ml 0.193±0.0031) 47.76±0.18 50 mg/ml 0.184±0.0041) 50.24±0.36 100 mg/ml 0.173±0.0012) 53.00±0.33 200 mg/ml 0.132±0.0032)64.17±0.22

表2 山茱萸水提取物不同作用时间对A549细胞的抑制率(n=4 ± s，%)

表2 山茱萸水提取物不同作用时间对A549细胞的抑制率(n=4 ± s，%)

与前一时间点比较：1)P＜0.05

浓度(mg/ml)24 h 48 h 72 h 25 42.34±0.27 47.76±0.181) 50.00±0.411)50 50.01±0.24 50.24±0.361) 53.69±0.211)100 47.29±0.15 53.00±0.331) 59.27±0.321)200 58.44±0.15 64.17±0.221) 70.33±0.161)

3 讨论

肺癌是目前全世界的头号癌症杀手，近年来其发病率和死亡率呈明显上升趋势，均占癌症首位〔7〕，每年因肺癌死亡的人数多于乳腺癌、肠癌和前列腺癌死亡人数的总和，临床通常采取手术、放化疗、免疫及中药等多学科综合治疗。目前针对肿瘤生长的某些主要环节研制安全有效的抗肿瘤药物是现在药物开发的新的发展方向，随着中医对肺癌的认识的深入，临床疗效不断提高，中医药疗法已成为治疗中晚期肺癌的主要方法之一，人们在研究中已发现有些中药不但能够有效地诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤增殖，而且还可以抑制肿瘤细胞向周围组织的侵袭〔8，9〕。

临床药理研究表明山茱萸具有免疫调节、降低血糖、抗血小板聚集、抗休克、强心作用、抗心律失常、抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗艾滋病和治疗不育症等作用，目前报道较多的有其抗衰老、增强免疫的作用，而其他研究却甚少。

本试验山茱萸水提取物对A549细胞增殖有较强的抑制作用，抑制程度与山茱萸水提取物的浓度和作用时间有关，浓度越高、作用时间越长对A549细胞的抑制作用越好，量效关系和时效关系明显。另外细胞毒性的形态学观察结果显示山茱萸水提取物作用于细胞后，可看到细胞圆缩，由贴壁生长转为逐渐脱落，细胞间出现明显空隙，细胞凋亡的特征明显。

染色体DNA的降解是细胞凋亡的标志。在细胞凋亡的后期，半胱氨酸蛋白酶激活的内源性核酸内切酶切断了核小体间的染色体DNA，双链断裂，由此产生了一系列大小为180至220碱基的DNA碎小片段，这些片段在凝胶电泳上通过染色呈现出“阶梯”样。经山茱萸水提取物作用的A549细胞DNA提取有DNA Ladder凋亡条带的出现，说明山茱萸水提取物能诱导A549细胞凋亡，这为今后进一步研究山茱萸的抗肿瘤作用机制提供了试验依据。

1 张 聪，金德庄.山茱萸的研究进展〔J〕.上海医药，2008;29(10)：464-7.

2 李满郁，王艳铭，杨立伟.山茱萸药理作用研究〔J〕.中医药信息，2005;22(4)：33.

3 张兰桐，袁志芳，杜英峰，等.山茱萸的研究近况及开发前景〔J〕.中草药，2004;35(8)：952-5.

4 刘 洪，许惠琴.山茱萸及其主要成分的药理学研究进展〔J〕.南京中医药大学学报，2003;19(4)：254-6.

5 季宇彬.中药多糖的化学与药理〔M〕.北京：人民卫生出版社，2005：226-30.

6 李宜明，沈业寿，王 清，等.抗肿瘤药物的筛选方法〔J〕.安徽大学学报，2005;29(1)：90-6.

7 孙建立.中医药治疗肺癌的机理研究概况〔J〕.上海中医药大学学报，2001;15(1)：61-4.

8 王玉芝，蒲 斌.中药诱导肿瘤细胞凋亡研究进展〔J〕.中国中西医结合外科杂志，2004;10(4)：331-3.

9 张 萱，张培彤.近20多年来治疗肺癌中草药研究概况〔J〕.中国肿瘤，2002;11(6)：330-2.

R734.2

A

1005-9202(2012)23-5184-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.038

保定市科技局科学研究与发展计划项目(09ZF011);河北省人口与计划生育委员会科研计划项目(2009-B18)

1 河北大学医学培训中心 2 保定市第一中心医院急诊科

王恩军(1977-)，男，讲师，硕士，主要从事抗肿瘤中药及药理研究。

〔2011-07-25收稿 2011-12-12修回〕

(编辑 曹梦园)