慢性粒细胞白血病患者骨髓间充质干细胞的分离培养及成脂分化

冯丹琴，黄 波，刘 静，李 静，章海斌，肖 芸，熊火梅，陈希敏，王小中

(1、南昌大学第二附属医院检验科，江西 南昌 330006；2、南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌 330006)

ABL酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼、达沙替尼、尼罗替尼是BCR-ABL1激酶诱导的慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)慢性期的一线治疗药物。酪氨酸激酶抑制剂可以大量减少白血病细胞，但却无法清除白血病干细胞。所以，一些患者用酪氨酸激酶抑制剂治疗后产生耐药性[1]。对于酪氨酸激酶抑制剂耐药的CML患者来说，异体基因造血干细胞移植是首选的治疗方法。在造血干细胞移植之前用酪氨酸酶抑制剂对病人进行治疗，能为移植创造良好状态[2-3]。然而，造血干细胞移植诱发移植物抗宿主病已见报道[4-5]，为了减少移植排斥反应，可以用患者自身的BMSCs支持造血干细胞的造血作用。本实验进行了CML患者BMSCs的分离培养及成脂分化，为后续研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 肝素化骨髓来源于南昌大学第二附属医院和第一附属医院血液科CML患者，Ficoll分离液(1.077g/ml)(Solarbio)，低糖 DMEM(L-DMEM)培养基(Hyclone)，胎牛血清 FBS(Hyclone)，青链霉素混合液(Solarbio)，胰蛋白酶-EDTA消化液0.25%(Solarbio)，地塞米松(Sigma)，1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤 IBMX(Sigma)，吲哚美辛(Sigma)，牛胰岛素(上海第一生化药业)，油红O染料(Sigma)，4%多聚甲醛(碧云天生物公司)，分析纯异丙醇都是商品化试剂。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分离、培养 在10ml玻璃离心管中加入2ml Ficoll分离液，再将2ml肝素化骨髓缓慢加至Ficoll分离液表面。2000r/min离心20min，用微量移液器小心吸出分界面的白膜层，PBS清洗1遍，用L-DMEM培养基(含有10%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素)重悬，以 1×106密度接种于塑料培养瓶中，放入37℃ 、5%CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱培养。3d后全量换液，以后每隔2d全量换液。待贴壁细胞密度达到60%后用胰酶消化传代。

1.2.2 BMSCs的成脂分化 第二代BMSCs密度达到60%～70%后，用胰酶消化，以密度1×105个细胞接种到35mm培养皿中。培养6d后，待细胞密度达到50%～60%，加入诱导液 (L-DMEM培养基含有10%胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、地塞米松1μmol/L、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤0.5mmol/L、吲哚美辛 50μmol/L、牛胰岛素 5mg/L)。每隔2d用诱导液全量换液。

1.2.3 油红O染色 油红O染料工作液的配制：油红O染料粉用异丙醇完全溶解，成为油红O染料的储存液。将储存液和三蒸水按3:2比例稀释后过滤，配制成油红O染料的工作液(要求工作液配制完成后，20min内用完)。成脂诱导培养3周后，去掉培养皿中的细胞培养基，加入4%多聚甲醛2ml进行预固定，5min后去除，再加等量的新鲜4%多聚甲醛，固定60min，去除多聚甲醛。用PBS清洗1遍，待细胞培养皿完全干后再加油红O染料工作液2ml染35min，去除油红O染料工作液，用三蒸水洗2遍，在倒置显微镜下观察结果。

2 结果

2.1 BMCSs的分离、培养 Ficoll分离液(1.077g/ml)分离得到的单个核细胞3 d后贴壁，倒置显微镜下观察到，细胞呈细而长的梭形或多角形，12d后细胞密度达到60%。细胞传代后，3d可贴壁，10d后细胞密度达到60%～70%，见图1。

图1 分离培养第二代BMCSs的形态(第10d，×400)

2.2 BMSCs的成脂分化 加入诱导液48h就有少量的细胞出现折光性强、少而小的脂肪滴，到第8d细胞内脂肪滴明显增多、脂肪滴体积也逐渐增大，见图2。第21d有80%的细胞都分化为脂肪细胞，细胞外形变为圆形或椭圆形，脂肪滴大而多、折光性强，见图3。

图2 第三代BMCSs成脂诱导后形态(第8d，×400)

图3 第三代BMCSs成脂诱导后形态(第21d，×400)

2.3 油红O染料 油红O染色后，细胞内的脂肪滴染成红色，见图4。

图4 第三代BMCSs成脂诱导后油红染色形态(第21d，×400)

3 讨论

BMSCs具有自我更新及多向分化的潜能，在一定条件下能诱导分化成骨、软骨、骨骼肌、肌腱、韧带、真皮和脂肪[6]。本实验用地塞米松、牛胰岛素、吲哚美辛、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤成功诱导了慢性粒细胞白血病患者的BMSCs向脂肪细胞分化。表明，本实验分离的慢性粒细胞白血病患者的BMSCs具有较强的分化能力，状态良好。Ito等[7]证明人BMSCs只有在地塞米松、牛胰岛素、吲哚美辛、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤同时存在的情况下才能分化为脂肪细胞，其中任何一种药物单独作用都无法成功诱导成脂分化。这其中的药理作用机制至今仍未完全阐明。

CML是多能造血干细胞恶性增生性疾病，其特征是具有费城染色体和融合的BCR-ABL基因。对于ABL酪氨酸激酶抑制剂耐药CML患者，同种异体基因骨髓移植是首选的治疗方法[2]。然而骨髓移植存在移植物抗宿主反应，容易导致移植失败。Lazarus[8-9]和 Jootar[10]研究表明，BMSCs 能强烈而直接地抑制T淋巴细胞的增生。因BMSCs具有抑制免疫反应的特性，能有效减少移植物抗宿主的反应疾病，所以，在骨髓移植中起到重要的作用。Lazarus[8-9]研究结果显示，恶性疾病患者的BMSCs在体外扩增后，能通过静脉安全有效地输入患者自身体内，并且显著减少了急性和慢性的移植物抗宿主反应。BMSCs不仅具有抑制免疫反应的特性，而且是骨髓微环境的重要组成部分，能够支持造血干细胞的造血作用。Koc[11]和Noort[12]研究表明BMSCs能分泌大量的细胞因子 (包括IL-6、IL-7、IL-8、IL-11，Flt-3 ligand,和 SCF 等)支持骨髓造血干细胞的造血作用，促进造血干细胞的移植。另外，Zhao等[13]研究显示CML患者的BMSCs并不存在费城染色体，也不表达BCR-ABL融合基因，它们能通过分泌造血干细胞的细胞因子，支持造血细胞的生长。和同种异体的BMSCs相比，病人自身的BMSCs是理想的干细胞资源。CML患者自身的BMSCs的移植不仅能减少移植物抗宿主的反应疾病，而且能促进造血功能的恢复，所以BMSCs运用于CML的治疗具有广泛前景。CML患者急变时骨髓标本比较难抽取，考虑到标本的宝贵，本次实验采用2ml的骨髓标本。CML患者骨髓中的白细胞数比较高，但实际分离培养BMSCs时，BMSCs不容易贴壁生长。细胞首先在培养瓶中散在聚集贴壁生长，呈细长梭形或多角形。在等待散在聚集的BMSCs融合时，发现它们很难完全融合，时间长了容易老化或成骨分化。Zhang等[14]研究发现BMSCs和CML细胞共培养时，BMSCs能通过分泌大量的α-干扰素抑制CML细胞的生长。由此我们推测，当CML细胞疯狂生长的同时，是否反向抑制着BMSCs的生长？这还有待于进一步的验证。本实验室建立的慢性粒细胞白血病患者骨髓间充质干细胞的培养方法为我们后续的实验研究打下了良好基础。

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