罕见开米拉A3B3血型的分子生物学研究

陈爱蓉，黄 毅

(北京大学深圳医院，广东 深圳 518036)

开米拉(Chimeras)是指一个个体中同时存在两个或以上不同来源的细胞的现象[1]。开米拉可以分为先天性的(如双生子之间通过血管交叉吻合而产生的)和获得性的(如异体造血细胞输注或移植)。目前，已经发现的开米拉现象主要有两种：一种是血型开米拉，也称做Twin Chimeras，是由于双生子之间的血管存在交叉吻合，造血细胞通过吻合的血管交换而产生的。另一种开米拉为全身性的开米拉，又称为 Tetragmetic Chimeras[2，3]，是指同一个体的不同组织中存在着不同来源的细胞的现象。这两种开米拉现象可以单独或同时存在。

人类血型开米拉十分罕见，常常是在ABO血型鉴定中检测到同时存在两种红细胞而被发现的。开米拉现象常常会导致ABO血型遗传学的不相符。本文以一例12岁的男孩和他的父母、祖父3代4人的家系为研究对象，对罕见的血型开米拉进行分子遗传学的研究。

1 材料与方法

1.1 标本来源 检测对象是一个12岁的男孩，因发现右下腹包块伴腹痛2d入我院，嵌顿疝术前常规血型鉴定中发现血型鉴定困难。我们分别采集了该男孩和他父母、祖父共计4人的血液标本7ml：5ml不抗凝血，用于ABO血型分型；2ml EDTA抗凝血，用于DNA检测。该家系籍贯为湖南韶山，均没有输血史及血液病史，患者为独生子女。

1.2 实验方法

1.2.1 ABO血型血清学鉴定 血型正反定型、吸收放散试验、唾液型物质测定均按常规标准的试管法，其中2套单克隆抗A、抗B血清(长春博德，长春生物制品有限公司；Dominion Inc，加拿大)，抗AB(Bioscot，英国)、抗 A1 植物凝集素(Immucor公司)、抗H血清(Dominion公司)，反定型红细胞(上海血液技术公司)。

1.2.2 ABO基因PCR-SSP(聚合酶链式反应-序列特异性引物)分型 快速盐析法从样本外周血中抽提基因组DNA，DNA样品于-20°C冷冻保存。使用G&T公司ABO基因分型试剂盒进行等位基因分型[4，5]，该试剂盒含有4对序列特异性引物，通过PCR-SSP分别检测ABO基因核苷酸序列的A1，A201，O1和B4个等位基因。内对照为扩增人类生长激素(HGH)基因的扩增产物为207bp。采用热启动技术即 95℃预温 5min，然后 95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 90s进行30个循环，72℃延伸 5min进行扩增。PCR产物检测：4.0%琼脂糖，10v/cm电泳25min。紫外灯下确定结果。

1.2.3 家系的ABO基因PCR扩增产物的克隆测序使用自行设计的引物AF1，AR1，进行包含ABO基因第6外显子、第6内含子、第7外显子约2200bp片断的PCR扩增，每种PCR反应体系包括dNTP 1mM，MgCl21mM，2×GC buffer Ⅱ2μM，LATaq 酶2U(Takara大连宝生物公司)，模板DNA 200ng/ul，每条引物1μM；终体积50μl。反应在PE9600扩增仪上进行，95℃ 10min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃150s，30个循环；72℃延伸10min。胶回收，使用TA Cloning Kit试剂盒(Invitrogen公司)进行克隆，使用2.1载体转染进感受态TOP10细胞，挑取随机菌株，抽提所需质粒DNA(小量质粒快速抽提纯化试剂盒 上海华舜公司)，使用表中所列的测序引物 AF2、AF3、AF4、AF5、AF6， 在 ABI 3100 测序仪上检测，SeqPOP6BDv 1软件分析结果。这5个引物都是正向引物，前一引物3’端和后一引物5’端会产生重叠。这样得到包括完整的Exon6和Exon7的基因序列。

1.2.4 HLA-A、B、DRB1 3个位点的 PCR-SSP分型使用HLA分型试剂盒 (Dynal Biotech LLC，WI53223)，按照厂家提供操作规程，PCR-SSP法对HLAⅠ类(A，B)，Ⅱ类(DRB1)等位基因分型，琼脂糖电泳产物，紫外灯下确定结果。

1.2.5 STR-PCR扩增 用双盲法复合短串联重复序列(short tandem repeat，STR)位点荧光标记扩增法检测 15个常染色体位点(D5S818、D13S317、D7S820、D8S1179、D21S11、D18S51、D3S1358、VWA、FGA、TH01、D16D539、D2S1338、D19D433、TPOX、CSF1P0)和1个性染色体Amelogenin位点来鉴定3代亲缘关系。使用ABI AmpFlSTR PCR扩增试剂盒 (Biotest)，对4个家庭成员的DNA扩增，ABI Prism3100 DNA测序仪以及ABI Genotyper 3.7软件对扩增产物及STR等位基因进行分析。 根据公式(I=X/Y)，将每个STR结果与中国南方汉族人群的STR等位基因频率比对，计算出PI值。

表1 用于克隆扩增及序列测定的引物

2 结果

2.1 ABO血型鉴定

患者血型鉴定实验中，正定实验显示与抗A、抗B抗体反应，肉眼观察凝集颗粒较小，镜检下呈现混合外观：有凝集的细胞团，有游离的红细胞；反定实验显示该男孩血清中没有A抗体，B抗体；吸收放散试验、唾液型物质试验均显示含A、B抗原，血清学鉴定该男孩为A3B3型，祖父、父亲、母亲的血型分别为正常的A型、O型和AB型。血型结果如图1。

图1 罕见开米拉血型家系图谱

2.2 ABO基因分型及克隆测序结果

如图1所示，AB O基因分型祖父为A1O1，父亲为O1O1，母亲为A1B，而患者的电泳中出现了A1、B1、O13 个等位基因条带，其中 B1、O1条带清晰，A1条带模糊。为排除PCR-SSP法假阳性，进一步运用克隆测序技术，对患者混合培养的PCR产物随机挑取得到的21个重组克隆进行分析，与标准序列(A101等位基因，Genbank：AF134412)相比较，这些克隆产物包括1个A102等位基因克隆，6个B101等位基因克隆，以及15个O01等位基因克隆 (如图2)。 综上，显示该男孩为 A102、O01，B101嵌合的三倍体开米拉。

图2 A102、B101、O01 3个等位基因克隆测序图谱

2.3 PCR-SSP法HLA分型结果

HLA-A、B以及HLA-DRB1分型结果为如下(表2)：表中红色字为额外的单倍体。本文中电泳条带不是太清晰故判断为额外单倍体，可能是此等位基因在体内少量存在。

表2 HLA-A、B以及HLA-DRB1分型结果

2.4 STR-PCR扩增

常染色体STR位点检测结果显示该男孩的D8S1179和vWA位点为三倍体。D8S1179额外的单倍体可能来自于父母双方，vWA位点额外的单倍体来自父亲一方(如图3)。

图3 STR位点中D8S1179和vWA位点图谱

3 讨论

在这一家系中，该男孩在外科手术前常规血型鉴定出现困难，后经详细的血清学方法鉴定为A3B3型后，父母分别为O型和AB型，又出现与其父母的血型不符合常规的遗传规律。而STR实验可确定患者与父母的亲权关系。深入探讨该家系的ABO遗传基础显得非常迫切。

原则上ABO血型遗传符合孟德尔经典的遗传规律，到目前为止，只报道过几例ABO表型和孟德尔遗传规律相违背的现象。对这一现象，目前有4种可能的解释：1、Cis-AB型和B(A)型。Cis-AB型和B(A)型可能与A、B抗原的糖基转移酶异常有关。在这两种情况下，糖基转移酶具有双重功能活性[6,7]，既可以催化A抗原合成，又能催化B抗原的形成。2、ABO基因亚型的存在。这些亚型的表达程度主要与该等位基因表达增强或者连锁式遗传有关，或者可以说ABO基因在表达过程中会相互影响[8，9]。3、ABO基因的重组和转换，可以引起其表现型的多样性。在减数分裂时期，B和O等位基因会融合杂交，这一基因的杂交重组多发生于第6内含子中，重组后的杂交基因表现为A基因活性。这是因为第7外显子之前的核苷酸为B基因来源，而第7外显子为O基因来源，且O基因与第6外显子nt-261位G缺失的A等位基因很相似，故表现为A型。中国和日本已有相关的家系调查的报道[10，11]。R102/O杂交型基因个体，由于R102/O杂交基因有nt-261位G的缺失，而表现为O型，但是R102/B杂交基因的个体则表现为B(A)型。4、体内同时存在两种细胞系的开米拉或马赛克，表达成不同的血型。

本次研究中的这个男孩可确定为一例罕见的血型开米拉：21个混合培养的细胞克隆产物中，除了B101等位基因与O01等位基因，还发现一个A102单倍体，这可证明该男孩为开米拉血型。HLA-B、DRB1位点也发现额外单体，STR-PCR的结果显示，其15个常染色体位点中有2个位点均发现有2个以上等位基因，这一结果也证实了该男孩的开米拉状态。

由于患者没有输血史和移植病史，家系均为健康人群[12]，可以排除获得性开米拉。开米拉血型通常是在血液中同时找到两种来源的红细胞而被发现的。这个男孩的血型分型为A3B3型，ABO基因型分型为B101，O01和少量的A102。A，B和O基因的cDNA的结构高度近似[13]。O01基因只比A101基因少了一个核苷酸，即第6外显子nt261位的G缺失，导致阅读框架的移位，nt352位之后提前出现终止密码子，使其在117位氨基酸翻译后不能形成成熟的氨基酸，即该基因编码一个截短的蛋白质，该蛋白无催化结构域，故O基因为隐性基因。B101基因与A101基因的核苷酸有7个位点不同，即nt297，526，657，703，796，803，930。这些位点的差异，会导致4个氨基酸的改变(Arg176Gly，Gly235Ser，Leu266Met，Gly268Ala)[14]，从而表达4种不同的蛋白质。也正是由于这4种氨基酸的改变，导致糖基转移酶GTA(α-1，3-N乙酰基D-半乳糖基转移酶)转变为GTB(α-1，3-D-半乳糖基转移酶)。

在PCR扩增过程中，数量少的细胞系会与血液中的主体细胞产生竞争性抑制，在常染色体STR中形成一个很小的峰。这一少量的细胞系可以通过PCR-SSP方法检测到其特异性的等位基因，同时，在HLA-SSP基因分型以及混合培养的细胞克隆产物中，也能发现。此例中患者低拷贝数量的A102基因是引起AB表达异常的原因。同时由于竞争性抑制，额外峰常形成比正常峰低的峰，易漏检；而有些常染色体STR位点没有出现异常，有一部分原因可能是由于父源或母源中含有相同的重复数目而被掩盖[15，16]。

由于缺少对该男孩的咽拭子、头发毛囊、以及指甲等的进一步分析，无法判断该例患者是否为A102/O01，B101，/O01四倍体全身性的开米拉。四倍体开米拉是在受精过程中，由2个卵细胞和2个精子相互结合而形成四倍体受精卵，这一受精卵继续进行减数分裂，就可能产生多种不同来源的混合细胞系。我们对该男孩的父母的STR检测的结果并不能区分该男孩是这两种开米拉中的哪一种，目前暂定为血型开米拉。ABO血型开米拉现象在血型检测中，仅凭借常规的检测技术很难发现。血型开米拉的发现多数血型鉴定过程中偶然发现的。本例血型开米拉的发现，使我们获得了一次很难得的研究开米拉遗传状态机会。同时，这一发现，也为我们再遇到疑难血型以及亲子鉴定的疑难结果提供了一种分析问题的思路与研究方向。

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