冠心病危重病人红细胞流变特性和血红蛋白结构的研究*

郝希平， 岳粮跃， 雷健明， 李周璇， 杨继旺， 侯增涛， 黄耀熊△

(1暨南大学生物医学工程研究所，广东 广州 510632；2河南科技大学物理与工程学院,洛阳市光电功能材料重点实验室，河南 洛阳 471003；3广西医科大学物理学教研室，广西 南宁 530021)

1000-4718(2012)05-0937-05

2011-09-13

2012-03-09

国家自然科学基金资助项目(No.30940019)

△通讯作者 Tel:020-85220469; E-mail: tyxhuang@jnu.edu.cn

冠心病危重病人红细胞流变特性和血红蛋白结构的研究*

郝希平1,2， 岳粮跃3， 雷健明1， 李周璇1， 杨继旺1， 侯增涛1， 黄耀熊1△

(1暨南大学生物医学工程研究所，广东 广州 510632；2河南科技大学物理与工程学院,洛阳市光电功能材料重点实验室，河南 洛阳 471003；3广西医科大学物理学教研室，广西 南宁 530021)

目的研究冠心病危重病人红细胞流变特性和血红蛋白结构的变化。方法利用动、静态图像分析技术和紫外-可见光谱技术，对pH 7.4生理环境下冠心病危重病人和健康人的红细胞和离体血红蛋白进行测定。结果(1)冠心病危重病人的青龄、老龄红细胞的形态大小参数与健康人不同，冠心病危重病人的青龄、老龄红细胞的接触面积、周长、长轴和短轴比健康人小，形状归化因子比健康人大。(2)冠心病危重病人的青龄、老龄红细胞的弯曲弹性模量比健康人大。(3)冠心病危重病人血红蛋白的吸收光谱与健康人一致，吸收峰的位置相同，吸收峰的吸收值没有明显差异。结论冠心病危重病人青龄、老龄红细胞的形态结构均不同程度向球形过渡，变形能力比健康人下降，但其血红蛋白结构未呈现与健康人不同的变化。

冠状动脉疾病； 红细胞； 血红蛋白

红细胞在体内的主要功能是运输氧气和二氧化碳，即把氧气从肺部携带到全身组织并把二氧化碳从组织携带到肺部排出体外。这一功能的正常发挥主要取决于两个因素：一是细胞内血红蛋白(hemoglobin, Hb)是否具有正常的构型并具有完善的携氧能力；二是细胞是否有合适的双凹形结构，并具有较好的变形能力使之可适应流场，便于通过包括毛细血管在内的各种血管到达全身各个组织器官。也就是说，红细胞的这一功能与其形态、细胞膜力学特性以及细胞内Hb的结构和功能密切相关。

人们十分重视研究不同条件对健康人红细胞及血红蛋白的作用[1-4]，我们之前研究了在pH 8.0时危重病人的血红蛋白的结构变化[5]，但至今没见研究报道冠心病危重病人的红细胞力学特性及血红蛋白的结构和功能情况。鉴于此，本文将探讨冠心病危重病人在pH 7.4正常生理环境下红细胞及血红蛋白的变化，这对临床诊断和治疗具有极大意义。

材 料 和 方 法

1材料

经伦理委员会批准并送达知情同意书情况下，分别取冠心病住院危重病人及健康成人的化验静脉血6例，肝素钠抗凝。6个病例中：(1)女，49岁，为冠状动脉粥样硬化心脏病、尖端扭转型室性心动过速，合并多发性脑梗塞；(2)女，63岁，为冠状动脉粥样硬化心脏病、急性前壁心肌梗死，合并肺部感染；(3)女，54岁，为冠状动脉粥样硬化性心脏病，心功能Ⅳ级，合并甲状腺功能亢进；(4)女，87岁，为冠状动脉粥样硬化心脏病、心功能Ⅲ级，合并原发性高血压Ⅲ级；(5)女，56岁，为冠状动脉粥样硬化心脏病，心功能Ⅲ级，合并重症高血压Ⅲ级；(6)男，61岁，为冠状动脉粥样硬化心脏病急性ST段抬高型心肌梗死，合并肺部感染。所有这些病人取血前都没有吸氧及均临床诊断为危重病人须进行有关监护室处理。健康成人6例血样，分别编号㊣1、㊣2、㊣3、㊣4、㊣5和㊣6作对照组。

2方法

2.1青龄、老龄红细胞流变特性的测定

2.1.1Percoll不连续密度梯度液的制备 红细胞的平均寿命为120 d，红细胞在其生存期内青龄、老龄红细胞的形态结构和变形能力有所差异。红细胞在衰老过程中，其表面积和体积会逐渐减少，但不改变胞内血红蛋白的量，所以随着红细胞老化，细胞的密度会逐渐变大。本文分离青龄、老龄红细胞采用的方法是Percoll密度梯度分离法[6]。

① 配制SA缓冲溶液 将三蒸水与配好的HBS溶液以体积比19∶1混合好，再加入适量牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)。

② 配制SB缓冲溶液 将Percoll液与HBS溶液以体积比19:1混合好，再加入适量BSA。

③ 配制PBS-BSA溶液 pH 7.4 PBS缓冲液，加入5 mmol/L 葡萄糖，1 mmol/L MgSO4，1 g/L BSA。

④ 将上述配好的溶液SA和SB按不同比例配成密度为1 063.61～1 081.44 g/L的5个点并形成密度梯度。然后依次按溶液5～1的顺序用移液枪向12 mL离心管沿管壁缓慢加入，这样不连续密度梯度液制备完毕。

2.1.2青龄、老龄红细胞的制备 取1 mL全血，放入离心机中以3 000 r/min离心3 min, 然后将血清和白膜层吸走，留下红细胞。再加入1 mL SA溶液与红细胞混匀，放入离心机中以3 000 r/min离心3 min，再吸走上层溶液留下红细胞，重复3次。最后将洗净的红细胞与SA溶液以体积比4∶6的比例混匀，然后将混合液加入准备好的梯度液中。最后放入离心机中以3 000 r/min离心20 min，上述操作均在24 ℃下完成。

健康人红细胞可分为4个条带，冠心病人红细胞的4条带界面不清，故取最上层命名为Y(青龄)，最下层命名为O(老龄)，进行对照研究。

提取的各层红细胞，放入细胞缓冲液中，3 000 r/min离心清洗2次，充分去除残留的Percoll分离液，再用细胞缓冲液重悬至原来的体积。观察红细胞时，先将红细胞悬液离心，取下层的红细胞稀释2 000倍用于红细胞形态结构的观察，稀释200 000倍用于变形能力的分析。上述稀释均用PBS-BSA液。

2.1.3青龄、老龄红细胞形态、变形能力的测定 用本实验室自行发展的多维显微图像分析技术，多维显微图像分析系统的基本结构如图1所示。

将制备好的红细胞样品置于Nikon TE300倒置显微镜下，显微镜卤钨稳流光源(100 W)光束通过孔径大小可调的光栅后，经聚焦透镜照射到样品上，其对应孔像直径在1 μm至200 μm范围可调。物镜收集的样品透射光通过半透半反镜后，通过显微生物医学图像分析系统，PCO 1600高分辨率制冷型CCD(Cooke)，摄取显微镜观测到的样品图像，再利用图像捕捉卡和计算机实现图像的显示、存储。

本文利用该技术拍摄活态红细胞白光下的显微图像，拍摄选用×40物镜，CCD的放大倍数为×20，得到的红细胞图像实际的放大倍数为×800。

Figure 1. Multidimensional microscopic image analysis system.

图1多维显微图像分析系统

2.1.4红细胞形态显微静态图像分析

(1)空间定标，通过测量标准测微尺的相关参数，求得在显微镜成像系统中所测的尺度大小和标准测微尺实际长度的比例关系。(2)拍摄具有合适对比度的红细胞显微图像，见图2，输入显微静态图像分析系统。(3)使用闭值分割技术并进行二值化处理，对红细胞边缘进行检测和分割。(4)计算每个红细胞的接触面积、周长、长轴、短轴、形状归化因子等几何参数。接触面积、周长、长轴、短轴、形状归化因子等是定量反映红细胞形态和大小的重要参数。其中形状归化因子(roundness facotr,REF)反映红细胞的几何形态，其值在0～1之间，越接近于1表示红细胞越接近圆形，其值等于1表示红细胞为圆形，其值小于1表示红细胞为非圆形。

Figure 2. Static image of red blood cells.

图2红细胞静态图像

将拍摄的红细胞形态图像导入显微静态图像分析软件，按照操作步骤，利用该软件测量分析不同条件下红细胞形态和大小的参数。每个条件下测量分析180个红细胞，取其平均值。

2.1.5红细胞的显微动态图像分析

(1)用倒置相差显微镜，通过专用图像摄录系统摄录带Flicker光晕的单个活态红细胞的动态图像，见图3。(2)设定亮度域值，在晕边缘的最上、最下、最左、最右4个方向规定4个等域值点。(3)对动态连续拍摄的图像进行自动分析，分析程序自动绘出2个垂直方向和2个水平方向的波动曲线。(4)求得细胞膜的各种力学参量。其中包括红细胞膜弯曲弹性模量Kc(表征细胞膜变形能力)。Kc值越小表明细胞膜的变形能力越好，细胞的生理特性越佳；反之，值越大表明细胞膜的变形能力越差，细胞越容易破裂。

Figure 3. The dynamic image of red blood cells.

图3红细胞动态图像

摄录红细胞的动态变化图像，每个录像需要摄录至少60帧，摄录的画面要保证每幅画面仅有1个细胞，以免影响后面的分析过程。将摄录的反映红细胞动态变化的录像导入显微动态图像分析软件，按照操作步骤，测量分析单个活态红细胞的Kc值，每个条件下测量分析180个红细胞，取其平均值。

2.2胞内血红蛋白结构的测定

2.2.1pH 7.4缓冲液的制备 分别称取71.6 g Na2HPO4·H2O、31.21 g NaH2PO4·H2O溶解在1 000 mL的双蒸去离子水中，分别配置20 mmol/L的 Na2HPO4和NaH2PO4溶液；调节Na2HPO4和NaH2PO4溶液的比例，配置成pH 7.4的缓冲液。缓冲液再用0.2 μm过滤器过滤，保证缓冲液无尘。

2.2.2血红蛋白的制备 分别取各样品全血1.5 mL，1 500 r/min离心10 min，去除上层血浆和脂质体。红细胞用0.9%氯化钠清洗3次，2 000 r/min离心10 min去除上清液。将洗后的红细胞放入4 ℃冰箱预冷15 min后，加入10倍体积的冰水，剧烈摇晃使红细胞破裂，4 ℃冰箱保存20 min，再4 ℃、12 000 r/min离心60 min，抽取上层红细胞的溶血物，将其用0.22的一次性过滤器过滤纯化，得到血红蛋白的粗提液。粗提液再经葡聚糖G-25过柱纯化，得到纯化的血红蛋白。纯化后的血红蛋白放入4 ℃冰箱保存备用。

通过测量540 nm吸收光谱的吸光值得到血红蛋白的浓度。提纯后的血红蛋白分别用之前配好的pH 7.4值的磷酸缓冲液稀释，以100 μL血样，加2.5 mL缓冲液[7]，制备紫外-可见光检测样品。

2.2.3血红蛋白的紫外-可见光谱测定 采用热电公司的UNICAM UV500型紫外-可见光谱仪，测量波长范围为350～700 nm，波长精度为±0.1 nm，对各样品检测。

3统计学处理

结 果

1冠心病危重病人青龄、老龄红细胞的形态大小

由表1可知，在pH 7.4环境下冠心病危重病人的青龄、老龄红细胞接触面积、周长、长轴、短轴比健康人小，形状归化因子REF比健康人大，形态大小参数有显著差异(P<0.01)。

表1冠心病危重病人与健康人青龄、老龄红细胞的形态参数

GroupContactarea(μm2)Perimeter(μm)Longaxis(μm)Shortaxis(μm)REFYp39.31±3.29**22.66±1.11**7.15±0.48**6.40±0.33**0.86±0.02**Yh44.99±4.5525.01±2.158.35±0.647.01±0.470.66±0.05Op33.38±1.0220.62±0.32△△6.80±0.14△△5.52±0.18△△0.89±0.02△△Oh40.32±9.9621.97±2.087.62±0.546.43±0.560.76±0.07

REF:roundness factor.**P<0.01vsYh，△△P<0.01vsOh.

2冠心病危重病人红细胞的弯曲弹性模量Kc

从表2可见，冠心病危重病人的红细胞的弯曲弹性模量Kc比健康人大，二者有显著差异(P< 0.01)。

冠心病危重病人的青龄、老龄红细胞接触面积、周长、长轴、短轴均比健康人小，而REF和Kc比健康人大，说明冠心病危重病人的红细胞已从双凹圆盘形向球形转变，变形能力变差，这与文献[8-9]结论一致。

表2冠心病危重病人与健康人青龄、老龄红细胞弯曲弹性模量Kc

GroupKc(×10-19J)Yp2.31±0.35**Yh1.51±0.23Op3.51±0.29△△Op2.33±0.27

**P<0.01vsYh;△△P<0.01vsOh.

3pH7.4环境下血红蛋白的紫外-可见光谱

图4是用UV500紫外-可见光谱仪测定的在pH 7.4情况下冠心病危重病人与健康人㊣1血红蛋白的吸收光谱，(图中只画出正常人㊣1的吸收光谱，其它㊣2-㊣6的吸收光谱与其一致)。415 nm是血红素的吸收峰，542 nm和577 nm分别是氧合血红蛋白的β和α吸收峰，它们反映氧合血红蛋白的携氧能力。

从图4 可见，在pH 7.4环境下危重病人血红素的吸收峰415 nm、氧合血红蛋白的β吸收峰542 nm和α吸收峰577 nm，均与健康人血红蛋白对应的位置没什么不同。

pH 7.4下冠心病危重病人与健康人血红素的吸收峰415 nm、氧合血红蛋白的β吸收峰542 nm和α吸收峰577 nm的吸光度值(A)在表3中给出。由于血红素、氧合血红蛋白的浓度与吸光度值呈正比，故表3提示，在pH 7.4环境下冠心病危重病人的血红素和氧合血红蛋白的浓度与健康人没有显著差异(P>0.05)。

冠心病危重病人与健康人在pH 7.4生理坏境下血红蛋白的吸收光谱完全一致，吸收峰的位置相同且吸光度值没有明显差异，说明其血红蛋白的结构没有改变。

Figure 4. The Hb absorption spectra of critically ill patients with coronary heart disease(①～⑥) and healthy people(㊣1).

图4冠心病危重病人与健康人血红蛋白的吸收光谱

表3pH7.4下冠心病危重病人与健康人血红蛋白的吸光度值

GroupA415A542A577Hb10.7870±0.04100.0899±0.00630.0998±0.0068Hb20.7350±0.04000.0800±0.00110.0953±0.0011

讨 论

红细胞功能的发挥决定于红细胞的几何形状、变形能力及其胞内血红蛋白的结构功能。本研究发现在pH 7.4环境下冠心病危重病人的青龄、老龄红细胞接触面积、周长、长轴、短轴均比健康人小，形状归化因子REF比健康人大，说明其红细胞的形状已发生了变化，特别是形状归化因子REF提示其已从双凹形结构转化为近球型。这种形态变化会影响其变形能力，所以其弯曲弹性模量Kc比健康人大，正进一步说明了这一点。其原因可能是由于：(1)冠心病患者膜胆固醇含量增高及过氧化脂质在体内积聚，影响了红细胞膜结构；(2)由于体内氧分压相对较低，膜表面ATP浓度降低，对钙泵的作用就会降低和消失，使细胞内钙潴留，影响了红细胞变形能力；(3)由于心肌缺血后组织缺氧，造成氧自由基大量释放及酸中毒，加重了红细胞膜的损害，从而使红细胞变形能力急剧下降。

但是，本研究发现冠心病危重病人与健康人在pH 7.4生理环境下血红蛋白的吸收光谱基本一致，各吸收峰的位置相同且吸光度没有明显差异，提示冠心病人尽管其红细胞已发生了形态变化，但仍没有影响到胞内，血红蛋白的结构基本没有改变。由于吸收谱反映的血红蛋白结构信息还比较粗，冠心病危重病人血红蛋白各级结构更为详尽细微的信息，还需要采用像拉曼散射谱等手段作进一步深入的研究，以得出更加准确全面的结果。

本研究揭示了冠心病危重病人的红细胞形态结构及变形能力、血红蛋白吸收谱等参数与健康人的异同，这些工作，对心血管疾病的治疗及红细胞的病理生理研究具有指导作用。

[1] Gedde MM, Yang E, Huestis WH. Resolution of the paradox of red cell shape changes in low and high pH[J]. Biochim Biophys Acta, 1999, 1417(2): 246-253.

[2] Rasia M, Bollini A. Red blood cell shape as a function of medium’s ionic strength and pH[J]. Biochim Biophys Acta, 1998, 1372(2): 198-204.

[3] 姚成灿，李校坤，黄耀熊. 温度对单个活态人红细胞携氧能力的即时影响[J]. 光谱学与光谱分析，2005,25(4):613-616.

[4] 吴正洁.酸、碱pH环境对人红细胞和血红蛋白的作用[D]. 广州:暨南大学, 2010.

[5] Hao X, Yue L, Lei J,et al. Effect of alkaline pH on size of hemoglobin from critically ill patient[C]∥Proceedings of 2010 First International Conference on Cellular,Molecular Biology,Biophysics and Bioengineering (CMBB),2010:452-454.

[6] Rennie CM, Thompson S, Parker AC,et al. Human erythrocyte fraction in “Percoll” density gradients[J]. Clin Chim Acta,1979, 98(1-2): 119-125.

[7] Adachi K, Asakura T. Aggregation and crystallization of hemoglobin A, S, and C.Probable formation of different nuclei for gelation and crystallization [J]. J Biol Chem, 1981, 256(4):1824-1830.

[8] 王红勇，何作云，李希楷.冠心病患者全血黏弹性的变化[J]. 中国动脉硬化杂志,2002,10(3): 236-238.

[9] 张苗青，李温娘.普拉固对冠心病合并高脂血症患者血脂及血液流变学的影响[J].中国病理生理杂志，1997,13(4)：391-392.

Rheologicalpropertiesandhemoglobinstructureofredbloodcellsincri-ticallyillpatientswithcoronaryheartdisease

HAO Xi-ping1, 2, YUE Liang-yue3, LEI Jian-ming1, LI Zhou-xuan1, YANG Ji-wang1, HOU Zeng-tao1, HUANG Yao-xiong1

(1InstituteofBiomedicalEngineering,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2LuoyangKeyLaboratoryofPhotoelectricalFunctionMaterials,SchoolofPhysicsandEngineering,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China;3DepartmentofPhysics,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:tyxhuang@jnu.edu.cn)

AIM: To study the rheological properties of red blood cells (RBC) and the structure of hemoglobin in critically ill patients with coronary heart disease.METHODSAt pH 7.4, the rheological properties of RBC and the structure of hemoglobin isolated from critically ill patients with coronary heart disease and from healthy people were studied with both static and dynamic imaging techniques and ultraviolet-visible spectroscopy.RESULTSThe rheological properties of RBC from the critically ill patients with coronary heart disease were significantly different from those of healthy people. The bending modulus, which indicates the rigidity of RBC, was greater in the patients than that in healthy people. The absorption spectra of the hemoglobin of critically ill patients with coronary heart disease were almost the same as those of healthy people.CONCLUSIONThe morphology and flexibility of RBC in critically ill patients with coronary heart disease are worse than those in healthy people, whereas the structure of hemoglobin in the patients is basically found no difference from that in healthy people.

Coronary disease; Erythrocytes; Hemoglobin

Q657.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.031